6.1 QBI-293A细胞培养
表现 可能原因 解决方法
细胞高死亡率/细胞脱壁/培养液发黄 支原体、细菌或酵母菌污染 1） 复苏一管新的细胞
2） 使用抗生素如链霉素和青霉素
细胞生长困难 a) 细胞太少 QBI-293A细胞传代时至少为5%汇合率，以保证其在一定时间内恢复生长
b) 细胞密度过高 QBI-293A如果经常培养密度过高，则有产生突变的危险，细胞汇合率切勿超过70%
6.2 感染力测定
表现 可能原因 解决方法
感染后细胞高死亡率 a） MOI过高 降低MOI
b） 细胞内含有内源性病毒（野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用，使非重组腺病毒也能感染细胞） 更换冻存的细胞，初代培养的较适用 ;
c） 一些细胞株有类似E1区活性 若一定要使用该细胞株,改用较低MOI
不感染 a) MOI太低 1) 尝试不同范围MOI。对于293之外的细胞株，MOI一般为1~200，对于某些难于感染的细胞株可能需要更高
2) 如果使用的是Infect+阳性对照，储存液在应用之前首先应扩增
b) 感染条件不够优化 1）任何感染试验都需以293细胞为阳性对照
2）以未感染的293作为阴性对照来监测细胞培养条件
c) 一些细胞可拮抗腺病毒的感染,需要很高MOI 联系技术支持（info•qbi.com）
6.3 转移载体克隆
表现 可能原因 解决方法
转化大肠杆菌后无菌落形成 a） 抗生素应用不当
b） 转化效率差 .
c） 制备的质粒质量差 使用50ug/ml卡那霉素
确证细胞是否具有转化活性
用氯化铯或其它方法纯化质粒
转化后有太多菌落形成 培养基中无抗生素 培养基中加入卡那霉素
筛选的克隆中无目的基因 a） 不匹配粘末端连接
b） 钝末端连接导致无转化
c） 连接头太短，不能被有效切割
d） Taq酶在PCR片段末端产生太多突出性腺嘌呤 确证酶切后DNA粘末端是否匹配加大连接酶量，确证克隆位点已正确应用，Klenow进行钝化 确证连接头之间有足够的碱基对以供正确酶切。详细信息可向内切酶供应商查询
Taq酶在PCR产物3’末端可产生一个额外的腺嘌呤。必须移去这个额外的腺嘌呤（可用Klenow）或者使用产生钝末端的温度稳定性聚合酶
转移载体重组子的分子量不正确 使用了错误的载体或克隆基因 cDNA用胶纯化，确保连接前无其它载体污染
限制性内切酶无法切割质粒 a） 甲基化
b） 酶已失活
检验切割的序列是否对甲基化敏感，若是，则在对甲基化不敏感的细菌如GM33中扩增质粒使用新鲜的酶和制造商推荐的缓冲液
6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组
表现 可能原因 解决方法
菌落少或无菌落 a) 转化效率不够
b) 抗生素使用错误或浓度过高
c) 制备的质粒质量差
d) 细胞转化活性
e) 使用了错误的细菌株 1） 按照试验盒说明书进行操作，这是一个关键步骤，必须使用最优条件
2） 向电穿孔仪制造商查询适用于这一细胞的特定操作方法
抗生素为50ug/ml卡那霉素
1） 用氯化铯或其它方法纯化质粒
2） 胶纯化可降低背景菌落的形成，但也可能降低了转化效率。当转化效率太低时避免使用胶纯化
1） 试剂盒中提供的细菌都具有电穿孔转化活性，如果使用其它方法进行转化，则必须将细胞制备为化学转化活性
2） 细菌必须正确保存以免丧失转化活性，参照推荐的方法保存
使用试剂盒中提供的BJ5183细菌株，DH5α仅供用于重组子的扩增，因其无重组活性。
菌落过多 a) 转移载体和病毒DNA的比率过高 I^1,
b) 转移载体用PmeI线性化不完全
c) 卡那霉素质量差或量不够 1） PmeI消化后用胶纯化或去磷酸化质粒
2） 共转染时减少转移载体的量，推荐比率为：1ug转移载体:0.1ug超螺旋DAdEasy-1 DNA
PmeI酶切时减少DNA量，检查内切酶是否具有活性
使用新鲜的卡那霉素，浓度为50ul/ml
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