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QBI-293A细胞培养



录入时间:2009-8-17 11:45:51 来源:青岛海博

5.1 QBI-293A细胞培养
293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下,QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代,则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代,最好复苏一管细胞开始新的培养。所以,我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。
QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养,该培养液还含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为2%~10%,视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明,培养基描述为DMEM后加血清浓度(如:DMEM5%表示:含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清)。QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作,在健康状态时,它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落,即所谓的细胞病理效应(CPE)。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则,这一点是至关重要的。抗生素可用可不用,但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。 
QBI-293A细胞生长的相对密度见下表:
表2:汇合率与细胞数量  
汇合率(%) 60mm培养皿 100mm培养皿
50 1.60×106 3.5×106 
75 2.40×106 5.25×106   
100 3.20×106 7.00×106  
 
5.1.1 QBI-293A细胞初始培养 
1. 将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。
2. 融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。 
3. 将细胞转入15mL无菌离心管中,加入10mL DMEM 10%,600×g离心5分钟使细胞沉淀。
4. 弃去上清。
5. 将细胞用10mL DMEM 10%重悬,轻轻打匀 
6. 转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。  
7. 在5% CO2孵箱中37℃培养过夜。 
8. 第二天观察细胞汇合率,若合适则可进行实验,否则按5.1.2所述继续培养。
5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 
QBI-293A细胞必须按1:10到1:20传代
1. 室温下胰酶消化1~3分钟使贴壁细胞脱落 
2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落,在倒置显微镜下观察细胞是否变圆,是否已从培养瓶表面脱落。
3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液,转入新的培养瓶中。在5% FBS中,细胞倍增的时间是26小时,在10% FBS中稍短一些。
5.1.3 QBI-293A细胞的冻存
建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%,以保证亚克隆的特定表型。
1. QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。 
2. 将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。
3. 以最小体积的DMEM 10%重悬细胞。
4. 用血球计数器进行细胞计数。 
5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重悬细胞,细胞终浓度为1×106/mL。
6. 无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。 
7. 将冻存管放入冻存盒中,-80℃储存24小时。这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率,适于冻存细胞。
8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。QBI-293A细胞若正确冻存,则可在液氮罐中保存数年。

 

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