注意：培养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点：  

无菌在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所用其它试剂也均为无菌。 DNA纯度  磷酸钙转染中所用的DNA必须是高纯度的，一些DNA污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会被污染物杀死。沉淀时间以前的资料都建议磷酸钙- DNA共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应20分钟。然而与此相反，最近的研究（Jordan等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建议共沉淀成分混合后1分钟即可将沉淀加入细胞培养板。这一时间上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。

 

4.4.1 细胞铺板

每块板都用DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到70%汇合率。由于共转染是通过细胞表面完成的，因此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。

 

1． 转染前一天以7.5×105 QBI-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.0~1.5×106。37℃ CO2孵箱中培养。CO2孵箱有助于保持合适的PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在CO2孵箱中。

2． 转染前3-4小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的生长力。将培养皿放回CO2孵箱中。  

4.4.2 磷酸钙转化技术 

1． 每个转染都必须用5ug无菌的线性化重组腺病毒DNA。

2． 标记一个1.5ml离心管为编号1。用微量移液枪加入169ul无菌水和5ul 2M氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ug DNA。

3． 准备第2管离心管（编号2），加入250ul 2×HBS缓冲液。 

4． 用1ml移液枪吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。加完后继续吹打5秒以使其完全混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分钟后再加入细胞培养皿内。

5． 在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。

6． 培养皿放入孵箱培养过夜。4小时后，沉淀颗粒在200×倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。

7． 第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液枪反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。