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AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增



录入时间:2009-8-17 11:44:46 来源:青岛海博

  将侯选重组子进行酶切分析,验证其结构。比如:PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析,鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5α中进行扩增:转化DH5α只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需的,因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的,会迅速出现缺失,而在DH5α中能很容易地获得大量DNA。
1. 将DH5α感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。
2. 将1-5ul DNA加入40ul DH5α感受态细胞中,DNA必须用水溶,避免含有离子。
3. 将DH5α感受态细胞转入2mm电穿孔杯,防止形成气泡。
4. 按照说明转化DH5α:Bio-Rad仪器一般使用的参数为:200 Ohms、25uF、2.5KV;BTX仪器则为:50 Ohms、2.5KV、C=0。
5. 将转化混合液重悬于1ml LB中。
6. 转入15-50ml离心管中,37℃振荡培养60分钟。
7. 培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α(1:10、1:100和1:1000)
8. 取100ul转化液铺在LB/Kan(50ug/ml)板上,37℃培养24小时。未用的转化液可在4℃保存-2周。
9. 每个重组子挑1~3个克隆转入5ml LB扩增,以备有足够量质粒。这时,用内切酶再次分析重组DNA,以确证含有插入基因,以及重组子的稳定性。 
10. 用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。 
11. 取5ug质粒用PacI消化,酚/氯仿抽提一遍,乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul 0.1×TE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。

 

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