1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
　　本标准适用于出口食品的检验。

2　设备和材料
2.1　吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。
2.2　水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3　培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。
2.4　冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。
2.5　均质器。
2.6　乳钵和研棒。
2.7　平皿：直径90mm。
2.8　天平：感量0.1g。
2.9　显微镜。
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12 菌落计数器。

3　培养基及试剂
3.1　月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。
3.2　煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3  EC 肉汤。
3.4　伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5　营养琼脂斜面。
3.6　色氨酸肉汤。
3.7  MR-VP培养基。
3.8  Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9　结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10　Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。

4　样品制备
4.1　以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。
4.2　不同食品样品匀液的制备
4.2.1　液体食品
以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。
4.2.2　固体和半固体食品
　　以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。

5　大肠菌群的测定
5.1　大肠菌群MPN值的测定
5.1.1　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。
5.1.2　将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3　观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。

5.2　大肠菌群的证实试验
5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2　置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4　结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样
品中大肠菌群的MPN值。

6　粪大肠菌群测定
6.1　用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3　记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4　结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。

7　大肠杆菌测定
7.1　将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。
7.4　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1　色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
7.4.5　革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
　　靛 基 质┃　　 MR　　 ┃ 　　VP　　 ┃　 枸椽酸盐 ┃ 鉴定(型别)
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃典型大肠杆菌
　　　　－　┃ 　　＋　 　┃ 　　－ 　　┃ 　－ 　　　┃非典型大肠杆菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　＋　┃　　 ＋　　 ┃　　 －　　 ┃ 　＋ 　　　┃典型中间型
　　　　－　┃　　 ＋ 　　┃ 　　－ 　　┃ 　＋　　　 ┃非典型中间型
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
　　　　－　┃　　 － 　　┃　　 ＋　　 ┃　 ＋　　　 ┃典型产气肠杆菌
　　　　＋　┃　　 － 　　┃ 　　＋ 　　┃ 　＋ 　　　┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
　　如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。
7.5　结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。

8　大肠菌群固体培养基测定法
8.1　样品制备同第4章。
8.2　计数
8.2.1　选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。
8.2.2　将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。
8.2.3　待琼脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆盖平板表层。
8.2.4　翻转平板,置于36±1℃培养18～24h。
8.2.5　选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6　证实
8.2.6.1　从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。
8.2.6.2　将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7　结果报告
　　经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
　　例：10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接
种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：
　　100×6/10×10**4/g(mL)＝6.0×10**5/g(mL)
附　录 A　
　　　　　　　　　　　　　　培养基和试剂
　　　　　　　　　　　　　　　(补充件)
A1　月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤
　　胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g
    氯化钠　　　　　　　　　　　　　5.0g
　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　5.0g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)             2.75g
　　磷酸二氢钾(KH2PO4)             2.75g
　　月桂基硫酸钠                    0.1g
　　蒸馏水                      1000.0mL
　　将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。

A2　煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
　　蛋白胨                        10.0g
　　乳糖　                        10.0g
　　牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL
　　0.1％煌绿水溶液              13.3mL
　　蒸馏水                     1000.0mL
　　将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.0～7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。

A3 EC肉汤
　　胰蛋白(月示)或胰酪(月示)     20.0g
　　3号胆盐或混合胆盐　　　      1.5g
　　乳糖　　　　　　　　　　      5.0g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)            4.0g
　　磷酸二氢钾(KH2PO4)            1.5g
　　氯化钠　　　                  5.0g
　　蒸馏水                    1000.0mL
　　将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。

A4　伊红美蓝琼脂(EMB)
　　蛋白胨                      10.0g
　　乳糖                        10.0g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)           2.0g
    琼脂                        15.0g
　　伊红γ(水溶性)　　 0.4g或2％水溶液20mL
　　美蓝　　　　　　　0.065g或0.5％水溶液13mL
　　蒸馏水　　　　　　       1000.0mL
　　在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液,摇匀,冷至45～50℃倾注平皿。

A5　营养琼脂斜面
　　牛肉膏　　　　　　　　　　  3.0g
　　蛋白胨 　　　　　　　　　　 5.0g
　　琼脂                       15.0g
　　蒸馏水                  1000.0mL
　　将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。

A６　色氨酸肉汤
　　胰胨或胰酪胨               10.0g
　　蒸馏水                  1000.0mL
　　加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。

A7 MR-VP培养基
　　(月示)胨　　　　　　　　　　7.0g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　　5.0g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)          5.0g
　　蒸馏水                    1000.0mL
　　将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。

A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤
　　磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O)　1.5g
　　磷酸氢二钾(K2HPO4)           1.0g
　　硫酸镁(MgSO4·7H2O) 　　　　 0.2g
　　枸椽酸钠(含2H2O)　　　　　　 3.0g
　　蒸馏水                   1000.0mL
　　将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。

A9　结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
　　蛋白胨　　　　 　　　       7.0g
　　酵母膏　　　　 　　　　     3.0g
　　乳糖　　　　　　　　　     10.0g
　　氯化钠　　　　　　　        5.0g
    胆盐或3号胆盐　　　        1.5g
　　中性红　　　　　　　　     0.03g
　　结晶紫　　　　　　　　    0.002g
　　琼脂                     15～18g
　　蒸馏水　　　　　　　　  1000.0mL
　　将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4±0.1。煮沸2min,将培养基冷至45～50℃倾注平板。临用时制备,不得超过3h。

A10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液 
　　贮存液
　　磷酸二氢钾(KH2PO4)        34.0g
　　蒸馏水                    500mL
　　将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol/L氢氧化钠约175 mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。
　　稀释液
　　取贮存液1.25mL, 用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。

A11 生理盐水
　　氯化钠　　　　　　　　　  8.5g
　　蒸馏水                1000.0mL 
　　将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。

A12 革兰氏染色液
　　结晶紫染色液：
　　结晶紫　　　　　　　　   1.0g
　　95％乙醇               20.0mL
　　1％草酸铵水溶液        80.0mL
　　将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
　　革兰氏碘液：
　　碘　　　　　　　　　　 1.0g
　　碘化钾　　　　　　　　 2.0g
　　蒸馏水              300.0mL
　　将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
　　沙黄复染液：
　　沙黄　　　　　　　　 0.25g
　　95％乙醇            10.0mL
　　蒸馏水              90.0mL
　　将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
　　染色法
　　a. 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。
　　b.　滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。 
　　c. 滴加95％乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
　　d.　滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
    结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。

A13 Kovacs氏靛基质试剂
　　对二甲氨基苯甲醛　　　　 5.0g
　　戊醇                   75.0mL
　　盐酸(浓)               25.0mL
　　将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。

A14 甲基红指示剂
　　甲基红                  0.1g
　　95％乙醇               300mL
　　将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。

A15 Voges-Pros kauer(V-P)试剂
　　甲液　
　　α-萘酚　　　　　　　　 　5.0g
　　无水乙醇              100.0mL
　　乙液
　　氢氧化钾                40.0g
　　用蒸馏水加至          100.0mL

附　录 B
　　　 　　　　　　　　　 1g检样中最近似值(MPN)表
　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)
使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。

━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
阳 性 管 数　　　 ┃　　　　┃　　　阳 性 管 数　 ┃
━━━━━━━━━┫　MPN 　┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001　 ┃　　　　｜ 0.1 0.01 0.001　　┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
　0　 0　 0　　　 ┃ ＜3 　┃　 2　 0　 0　　　　┃ 9.1
　0　 0　 1　　　 ┃　 3　 ┃　 2　 0　 1　　　　┃ 14
　0 　0　 2　　　 ┃ 　6　 ┃　 2　 0　 2　　　　┃ 20 
　0 　0　 3　　　 ┃　 9　 ┃　 2　 0　 3　　　　┃ 26 
　0　 1　 0　　　 ┃　 3　 ┃ 　2　 1　 0　　　　┃ 15 
　0　 1　 1　　　 ┃ 　6.1 ┃　 2　 1　 1　　　　┃ 20 
　0 　1　 2　　　 ┃　 9.2 ┃ 　2　 1　 2　　　　┃ 27 
　0　 1　 3　　　 ┃　　12 ┃　 2　 1　 3　　　　┃ 34 
　0　 2　 0　　　 ┃　 6.2 ┃ 　2　 2　 0　　　　┃ 21 
　0　 2　 1 　　　┃ 　9.3 ┃　 2　 2　 1　　　　┃ 28 
　0　 2　 2　　　 ┃　 12　┃　 2　 2　 2　　　　┃ 35 
　0　 2　 3　　　 ┃ 　16　┃ 　2　 2　 3　　　　┃ 42 
　0　 3　 0　　　 ┃　 9.4 ┃　 2　 3　 0　　　　┃ 29
　0　 3　 1　　　 ┃　 13　┃　 2　 3　 1　　　　┃ 36 
　0　 3　 2　　　 ┃　 16　┃ 　2　 3　 2　　　　┃ 44 
　0　 3　 3　　　 ┃　 19　┃　 2　 3　 3　　　　┃ 53 
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
　1　 0　 0　　　 ┃　 3.6 ┃ 　3　 0　 0 　　 　┃ 23
　1　 0　 1　　　 ┃ 　7.2 ┃　 3　 0　 1　　　　┃ 39
　1　 0　 2　　　 ┃ 　11　┃　 3　 0　 2　　　　┃ 64
　1　 0　 3　　　 ┃　 15　┃　 3　 0　 3　　　　┃ 95
　1　 1　 0　　　 ┃ 　7.3 ┃ 　3　 1　 0　　　　┃ 43
　1　 1　 1　　　 ┃　 11　┃ 　3　 1　 1　　　　┃ 75
　1　 1　 2　　　 ┃ 　15　┃ 　3　 1　 2　　　　┃ 120
　1　 1　 3　　　 ┃　 19　┃ 　3　 1　 3　　　　┃ 160
　1　 2　 0　　　 ┃　 11　┃ 　3　 2　 0　　　　┃ 93
　1　 2　 1　　　 ┃　 15　┃　 3　 2　 1　　　　┃ 150
　1　 2　 2　　　 ┃ 　20　┃ 　3　 2　 2　　　　┃ 210
　1　 2　 3　　　 ┃　 24　┃ 　3 　2　 3　　　　┃ 290
　1　 3　 0　　　 ┃　 16　┃ 　3　 3　 0　　　　┃ 240
　1　 3　 1 　　　┃ 　20　┃ 　3　 3　 1　　　　┃ 460
　1　 3　 2　　　 ┃ 　24　┃　 3　 3　 2　　　　┃ 1100
　1　 3　 3　　　 ┃ 　29　┃ 　3　 3　 3　　　　┃＞1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
注: ①本表采用3个稀释度 [0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。
　 ②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增加10倍,其余类推。
━━━━━━━━━━━
附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进
出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。
本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
中华人民共和国国家进出口商品检验局1992-12-28批准 1993-05-01实施