天花病毒和痘苗病毒 (Variola virus and vaccinia virus)

 〖HT5SS〗天花病毒引起传播迅速的烈性传染病——天花。天花曾是人类历史上的重 大灾祸 之一。 由于使用痘苗病毒疫苗预防天花，1977年天花在全世界流行终止，1980年世界卫生组织 (WHO)宣布，天花已经被消灭，不再用痘苗病毒疫苗预防天花。

 [BT4] 1.形态和理化学特性 痘苗病毒粒子的浮密度在稀释的缓冲液中为116g/cm3，在53%的蔗糖溶液中为1 25g/cm3，在酒石酸钾溶液中为12/cm3。 重量为45×10-15g。痘苗病毒和天花病毒在生理pH值时带有负电荷，痘苗病毒 的等电点为pH40，而天花病毒则为pH34。 痘苗病毒和天花病毒的外形和大小十分相似，大小为270×218nm左右。抗原性上也极相似 ，但二者毒力不同。

[BT4]2.抗原性 天花病毒的抗原性与痘苗病毒极为相似，病变皮肤中的抗原，可用琼脂扩散试验和补 体结合试验进行检测。机体感染这两种病毒 1周后，可用中和试验、补体结合试验和血凝 抑制试验进行各种抗体检测，但难以相互鉴别。

 [BT4]3.培养天花病毒和痘苗病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，接种2～3日后天花病毒 形成1mm 左右的光滑痘斑，痘苗病毒为中心坏死的大痘斑。这两种病毒能在鸡胚细胞和其它一些原代 细胞及传代细胞如HeLa等细胞中增殖，在培养细胞中，以细胞至细胞方式传播。

 [BT4]4.病原性 天花病毒经上呼吸道侵入患者机体，潜伏期8～15天。在潜伏期间，病毒在淋巴样组织中 增殖。病毒侵入机 体有后呈现如下的感染过程：①在侵入部附近的淋巴样组织中进行第一次增殖；②一过性病 毒血症及 感染全身巨噬细胞系细胞；③在这些细胞中进行第二次增殖；④第二次病毒血症；⑤出现临 床症状。 患者病初体温升高，并有头痛和四肢疼痛以及恶心、呕吐等症状， 在发病第3～4天 开始出疹。先是斑疹、丘疹、疱状疹。1～4天后形成水泡，此后2～6日发展成脓疱，此时往 往由于机体吸收了坏死组织成分(并非细菌继发感染)，而第二次发热。病人在出现皮疹的 同时 ，口腔、上呼吸道及食管上部粘膜也发生很多粘膜疹性小溃疡，其中含有大量天花病毒， 并通过飞沫传给易感者，这是天花病人排出病毒的主要方式。 皮肤上的脓疱逐渐干缩结痂，从病程的开始到结痂脱落 ，需2～4周。结痂脱落后 留下红色瘢痕，但瘢痕颜色随后渐渐消退。升高的体温常常在发 疹 后24小时内下降。病变多发生在面部，躯干部很少发生。天花在流行病学上分重型和轻型两 种，重型死亡率高达15%～30%，轻型死亡率低于1%。天花病毒只感染人、猴和兔。天 花病 毒除引起人类的严重感染外，以划痕接种猴子，可引起典型皮疹。接种家兔皮内，引起明显 的 局部病变，以划痕法接种眼角膜，角膜上出现透明小圆疱，随后因中 心部上皮脱落而形成凹陷。 痘苗病毒的宿主范围较广，它能引起人、牛、水牛、猪、猴、骆驼、象、绵羊、家兔及鼠 类的感染。痘苗病毒疫苗株成功地用于天花的预防，但疫苗株痘苗病毒仍有一些缺陷和不足 。如常发生种 痘后疹，以及种痘后紫癜、坏疽痘，最大的问题在于1/100万的种痘后脑炎(一过性脑炎 ) 和免疫缺陷患者的全身性发痘。 多年来的体外研究表明，痘苗病毒基因组中约1/3的基因，并非自身复制所必需，但体 内感染证明，某些非必需区是体内增殖必需的。对于痘苗病毒致病基因的研究表明，痘苗 病毒具有巧妙的生活方式，它有逃避机体免疫攻击的机制。痘苗病毒合成的35 kDa分泌蛋白与C4b结合，抑制经典的补体激活途径。痘苗病毒具有一定的抵抗干扰素的 作 用。另外，痘苗病毒还产生一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制痘苗病毒表达 的外源蛋白与抗体之间发生反应。痘苗病毒基因组中还存在着与肿瘤坏死因子、白介素1和 白介素6受体相对应的ORF，推测其产物可能与这些细胞因子受体结合。 痘苗病毒TK基因和HA基因也属致病基因。Paoletti等(1992)将痘苗病毒的TK、HA、ATI等1 8个基因进行定向缺失，得到缺失变异株NYVAC，将其接种小鼠脑内，计算小鼠50%致死量 ，发现这种变异株比原始株的毒力弱1万倍。另外NYVAC株只在鸡胚细胞中增殖，却不能在 人源细胞株中增殖。

 〖BT4〗5.免疫 天花痊愈后具有坚强的免疫力，可以持续终身，很少第二次患天花。 接种痘苗病毒后11～13天，可查到中和抗体、补体结合抗体和血凝抑制抗体，但抗体滴度很 低，持续时间较短。复种后7天，中和抗体滴度明显增高。 一次成功的痘苗病毒接种完全免疫持续时间为2年，长者可达5～7年或更久，此时虽可能发 生天花，但症状轻，病程短，死亡率低。

 〖BT4〗6.诊断 利用电子显微镜负染技术，可以直接进行快速诊断。即将丘疹和水疱期的病变部组织 接种鸡胚绒毛尿囊膜可鉴定病毒 。天花病毒为小痘斑，痘苗病毒为中心坏 死的大痘斑，牛痘和猴痘为出血性痘斑。天花病毒在鸡胚内生长温度的上界为385℃，而 痘苗病 毒温度上界为41℃。天花病毒不能在鸡胚成纤维细胞上形成蚀斑，而痘苗病毒则可形成蚀斑 。琼脂扩散试验、补体结合试验可检测抗原，中和试验、补体结合试验和红细胞凝集抑制试 验则可检测抗体。病毒DNA酶切图谱分析和病毒细胞感染肽图分析也有鉴别诊断意义。

 〖BT4〗7.痘苗病毒的起源 关于痘苗病毒的起源，学者们的意见不一致。有谓痘苗病毒是天花病毒连续通过兔体和犊牛 后形成的变异株，也有人认为痘苗病毒起源于牛痘病毒。有人甚至认为，Jenner的原始牛 痘毒株已被天花病毒污染，因此，痘苗病毒实际上是这两种病毒的重组型。

 〖BT4〗8.痘苗病毒的应用 1982年，Paoletti和Moss研究组将外源基因插入痘苗病毒的TK基因中，首次成功地构建了在 哺乳动物细胞中表达外源基因的重组痘苗病毒。10多年来，应用重组痘苗病毒成功地表达了 来源于植物、动物乃至人类的数十种基因。重组痘苗病毒具有如下特点： ①重组痘苗病毒仍然保留野生型痘苗病毒的特性，感染几乎所有源于哺乳动物的培养细胞 ，并表达外源蛋白； ②被表达的外源蛋白，在感染细胞中，能忠实地进行修饰； ③与其它病毒表达载体相比，具有较高的表达效率；④通过对动物接种重组痘苗病毒的方 法，能了解外源蛋白对个体的作用以及机体的免疫应答； ⑤表达抗原基因的重组痘苗病毒。可作为基因重组疫苗。 正因为有上述特点，痘苗病毒载体广泛用于分子生物学、细胞生物学、免疫学领域以及新型 疫苗的开发。

[BT4](1)基因组结构与复制 痘苗病毒基因组为两端交叉闭锁的线型双链DNA分子，根据毒株的不同，其长度变化在180k b～200kb之间，编码约200种蛋白质。基因组的两端向内，并有10kb的倒置重复序列，即序 列完全一致，方向相反，呈现倒置互补，其中含70bp～125bp的重复区。此70bp为痘苗病毒 的复 制所必需，其中20bp(ATTTAGTGTCTAGAAAAAAT)尤为重要。此末端倒置重复序列变异较大，即 使同一毒株其结构亦不尽相同。这种两端变异较大的序列，大多编码非必需蛋白质，但与病 毒毒力及宿主范围有关。 在痘苗病毒基因组中央区域约有120kb的保守区，核苷酸变异较小，变异率在10%左右。晚 期基因大多集中于此区，主要编码结构蛋白。痘苗病毒基因组含约198个主要ORF和65个 与其它基因重叠的小ORF，总共约含可编码263种左右蛋白质的潜在基因。痘苗病毒的阅读 码框架 间相距仅几个至几十个碱基，有的阅读框架相互重叠。基因组中无内含子，无基因编接机制 。 痘苗病毒增殖均在哺乳动物细胞浆中进行，并在20小时内完成一个病毒复制周期。过去 有人曾分离过无胸 苷激酶活 性(TK-)和无血凝作用(HA-)的痘苗病毒变异株。因此，目前为止人们常在TK基因或HA基 因中 插入外源基因进行表达。痘苗病毒基因组左侧20～30kb不稳定，在单纯的反复传代过程中 亦会发生某些基因的丢失。因此，也有人认为此区域为非必需基因群。

[BT4](2)重组痘苗病毒的制备 Paoletti等首次利用标记拯救技术，制备了插入有外源基因的重组痘苗病毒。制备重组病毒 时，首先准备含有痘苗病毒非必需区基因的质粒，在此非必需区中部插入痘苗病毒自身的启 动子(成为痘苗病毒表达载体)，启动子下游连接欲表达的外源基因。接着对已感染痘苗病毒 1～2小时的细胞，转化上述重组质粒，使重组质粒中所含的痘苗病毒非必需区序列与痘苗病 毒非必需区序列发生同源重组。外源基因在这一过程中重组到痘苗病毒基因组中，形成重组 痘苗病毒粒子。 应用磷酸钙法进行体内重组，得到的重组病毒只占全部子代病毒的01%左右，脂质体法可 使重组率提高到03%～05%，而电激法又可提高重组率10倍以上。为了提高重组率，将重 组质粒DNA与纯化的痘苗病毒DNA 混合，共同转化已感染痘苗病毒的细胞，可得到1/3的重组病毒。如果将重组质粒NotI酶切 片 段与痘苗病毒DNA的NotI酶切片段进行连接，进行体内重组，则可得到1/4的重组病毒。 最常用胸苷激酶(TK)基因区作为外源基因插入痘苗病毒的非必需区，只需5’溴脱氧尿 苷(BUdR)加压即 可得到TK重组病毒。也常用血凝素基因(HA)作为插入外源基因的非必需区，此时用鸡 红细胞筛选HA重组病毒，但由于痘苗病毒的自然突变，存在着TK-和HA-变异株，因此表 达 外源基因时应再增加筛选标志。例如利用β半乳糖苷酶基因、新霉素抗性基因(Neo)、 鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶基因(gpt)等，可在培养液中加入Xgal、G418、霉酚酸等试剂，以便筛 选出重组病毒。

 [BT4](3)疫苗制备 痘苗病毒载体已广泛用于外源基因的表达调控研究，逐步成为常规表达外源蛋白的工具 。利用痘苗病毒载体进行疫苗开发研究主要有如下两个大的方面。 首先，利用痘苗病毒表达外源基因生产多肽或亚单位疫苗。由于疫苗病毒表达的外源蛋白， 比细菌、酵母及多角体病毒表达系统更接近天然结构，病毒稳定性好，增殖滴度高，宿主范 围广，便于操作，且价廉容易生产。因此，如何构建和利用高效表达痘苗病毒载体系统成 为表达外源基因的关键一步。 其次，利用痘苗病毒载体进行重组活疫苗的研究。由于重组痘苗病毒不仅诱导机体产生体液 免疫，而且诱导坚强的细胞免疫。痘苗病毒作为基因重组活疫苗载体，不需佐剂即 可 免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可剌激机体产生免疫反应。表达的外源蛋 白在细胞内被修饰后，与自身的组织相容性复合体(MHC)结合，剌激CD+8T淋巴细胞( 细胞毒性T淋巴细胞)。 重组痘苗病毒已用于人类疾病的临床研究，有些重组痘苗病毒活疫苗已处于免疫观察阶段。 在北欧，从1989年起野外投放狂犬痘苗重组病毒3次，到了1990年后半叶投放区野生狐狸 及 其周围家畜，已无狂犬病发生。猴免疫缺陷病毒(SIV)痘苗重组病毒接种猴体后可抵抗强毒 的攻击。HIV1痘苗重组病毒接种人体，亦已进入临床试验阶段。 痘苗病毒在基因重组活疫苗研究中的优点之一，是可进行多价基因重组疫苗的制备。由于痘 苗病毒的基因组容量大，可插入25Kb的外源基因而不影响自身复制。因此，可将不同的外源 基因，特别是各种病毒保护性抗原基因一同插入痘苗病毒基因进行表达。这种尝试已有成功 的报道。 总之，痘苗病毒无致癌性，稳定性好，宿主范围广，基因组容量大，非必需区多，能诱发机 体产生坚强的体液免疫和细胞免疫等都是其突出的优点。虽然存在百万分之一的种痘后脑炎 和全身性发痘，但 随着对其基因组结构、功能的深入研究和改造，必将成为分子生物学、基因工程生物活性物 质生产、基因重组疫苗及多价疫苗研究的有效工具。