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    流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定



    录入时间:2009-7-8 13:37:45 来源:青岛海博

      流行性乙型脑炎病毒的分离和鉴定
      根据乙型脑炎明显的季节性和地区性及其临床特征,例如高热和狂暴或 沉郁等神 经症状,流行期中不难作出诊断。但是必须与其它的病毒性、细菌性和中毒性脑炎相鉴别。 由于母猪可能发生流产,公猪可能发生睾丸炎,还需注意与布氏杆菌病、细小病毒病以及生 殖和呼吸道综合症等鉴别。为了确诊,必须进行病毒分离和血清学试验等特异性诊断。 
     (1) 病毒的分离和鉴定:在动物发热初期,可采血液或血清分离病毒。动物死后, 应尽快(夏天不得超过2~3小时)采取脑组织分离病毒。各项操作以 及病料的运送,必须遵守“冷藏”和“快速”两个原则。根据作者等的经验,如将乳 鼠带到现场接种,可以明显提高病毒分离率。  乳鼠是应用最多的实验动物,也是多年来实践证明比较有效的病毒分离动物。 应用脑内皮下同时接种法或在脑内接种的同时,再较大量地作腹腔接种,例如02~0 5ml,常可提高病毒分离率。乳鼠发病时,离群、拒食、抽筋、消瘦, 此时即可采脑作 进一步传代或鉴定。但需注意,发病乳鼠常被母鼠吃掉,故应及时将母鼠取走。也可将上述材料接种于7~9日龄的鸡胚卵黄囊内,2~3天后收获胚体,再作乳鼠接 种。  近年来常用仓鼠肾原代细胞分离乙脑病毒,即在已经长成单层的仓鼠肾细胞内 加入该培养瓶(管)原营养液量1/5~1/10的接种材料,吸附30~60分钟后,加入维持液, 继续置37℃,每天观察1次,共7天,如发现“++”的细胞病变,即可收获,供传代或鉴 定用。仓鼠肾BHK21细胞系也可被用于分离病毒,接种病料后观察1周后如无CPE出现,可作盲传。  即使被检材料中含有病毒,但在初代接种小鼠或细胞培养物后,往往不见发病或 不出现细胞病变,这是野外毒株尚未适应实验动物或细胞培养物的缘故。 因此第1代接 种呈阴性结果时,应继续盲传2~3代,也就是经一定时间(7~10天) 而尚未发现动物发 病或细胞出现病变时,可按常法扑杀几个动物采脑,或选取几瓶细胞培养物作冻融处理, 再作下一代动物或细胞培养物的传代接种。  欲由蚊体分离病毒时,用捕蚊管或捕蚊器捕蚊。最好先在室内饲养2~3天,待胃血 消化,抗体消失,这样可以提高病毒分离率。分离时用氯仿将蚊熏死,鉴定分类,并以 25、50或100只为1批,装入灭菌的小瓶或试管中。随后加入2~3ml25%酒精生理盐水,  充分摇洗5~10分钟,倒掉酒精液,再用灭菌生理盐水或Hanks液洗2~3次后,移入玻璃 研磨器内,加入1~2ml05%乳白蛋白水解物或其它稀释液,磨细后移入离心管,以3 00 0r/min转的速度离心沉淀20分钟,吸取上清液,如上加入青、链霉素,置4℃感作1小时 后接种动物或细胞。细胞营养液内应加两性霉素,以免霉菌生长。 Hsu等在台湾南部 收集猪场的蚊,自1974年7月至1976年12月共捕蚊125 000只,分为1 650批,做成乳剂后 分别接种乳鼠和库蚊细胞培养物。在库蚊细胞培养物中分离到68株乙脑病毒,由乳 鼠脑分离到48株病毒,似乎说明库蚊细胞培养物比乳鼠更适于由蚊体分离乙脑病毒。新分离病毒的初步鉴定按一般方法进行,请参阅本书第十四章。随后再用乙脑标准 毒株和标准免疫血清与新分离病毒进行交叉补体结合试验、交叉中和试验、交叉血凝抑 制试验。也可应用小鼠进行交叉保护试验,即用新分离毒株和标准乙脑毒株分别制备 福尔马林灭活疫苗,给3周龄小鼠皮下接种01~02ml,共2次,间隔7天, 另留部 分小鼠不免疫作为对照。于第2次注射后两周,用不同稀释度的标准乙脑毒株攻击:采用腹 腔攻击、脑内刺激法,即在腹腔注射病毒的同时,给每只小鼠脑内注射003ml 生理盐水或肉汤。观察3周,记录各组小鼠的死亡和保护数。如为同种病毒, 则其抵 抗标准乙脑毒株的攻击量可比对照组高100~1 000倍, 并与以标准乙脑毒株免疫的小鼠 组的保护率相近。  检出病畜体内的病毒抗原,是快速诊断的需要,也是国内外正在探索和深入研究的 一个课题。作者等应用固相和液相补体结合试验、免疫粘附试验、反向间接血凝试验、 荧光抗体技术、免疫酶技术、125I放射免疫测定以及反转录多聚酶链RTPCR反应 等方法检测乙脑感染小鼠和自 然感染病马脑内的病毒抗原,都有较高的特异性和检出率。

     

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