5.增殖所有甲病毒均有相似的生物学特性。病毒在蚊等节肢昆虫中的增殖是其在自然界得以生存的一个重要环节。然而，在脊椎动物宿主体内的增殖对病毒在自然界中的生存却是不必需的。蚊是甲病毒的原始宿主。雌蚊叮咬受感染的脊椎动物宿主后，吸食的感染性血液积贮在蚊中肠的后部，这一段中肠由基底层环绕的单层上皮细胞组成。血液中的病毒首先感染这些细胞，随后，病毒越过肠管进一步感染血淋巴和神经系统，其后造成唾液腺的感染，这时蚊唾液中含有病毒，此时叮咬易感脊椎动物即可将病毒传给后者。病毒进入蚊细胞后，造成非溶细胞性感染，所以细胞不出现病变，成为慢性感染，使病毒在蚊体内长期生存下去。蚊也不因感染而发病，一但感染，将终身带毒。从蚊吸食感染性血液到蚊唾液中有病毒分泌这段时间一般为3天至2周，甚至更长，这取决于病毒的感染量、环境温度以及媒介昆虫的种类。一般来说，每种昆虫媒介对病毒的易感性是不同的，脊椎动物血液中的病毒必须达到一定浓度才能造成昆虫媒介感染，使病毒进一步传播，这一浓度称为感染阈(thresholddose)，不同昆虫媒介具有不同的感染阈。甲病毒可在许多哺乳类和鸟类的组织培养细胞中增殖。实验室主要应用鸡胚或鸭胚原代细胞、仓鼠肾原代细胞和BHK21细胞以及绿猴肾细胞(Vero或BSC1)等作为增殖和研究这类病毒的宿主细胞。甲病毒可在蚊细胞内良好增殖，但是其增殖动态与在脊椎动物细胞中的显著不同。初次感染时，甲病毒在蚊细胞内的产量可与脊椎动物细胞中的相比。病毒在脊椎动物细胞内可引起细胞病变，而在蚊细胞一般不产生细胞病变。蚊细胞在感染病毒后常发展为慢性感染，此时细胞可以继续正常地生长和增殖。这种带毒传代状态可以维持好几个月，许多病毒世代。不过细胞的产毒量此时明显降低，就SINV来说，每个蚊细胞每天只能产生1～5个蚀斑形成单位的病毒,而在脊椎动物，每个细胞每小时可产生2000个蚀斑形成单位的病毒。为什么甲病毒在脊椎动物培养细胞中引起明显的细胞病变，导致宿主细胞RNA和蛋白质合成迅速受阻,病毒产量极高，而在节肢昆虫细胞中却常常发生慢性持续性感染，病毒产量很低呢?一般认为，这与病毒在两种细胞中不同的成熟过程有关。在脊椎动物细胞中，衣壳蛋白与病毒RNA在胞浆内装配成核衣壳，在胞浆膜包上含有病毒糖蛋白的宿主细胞双层内质膜而成熟，然后从细胞膜出芽释放。而在节肢昆虫细胞中，病毒粒子的装配完全在胞浆内由膜样物包围的囊泡中进行，囊泡内含有核心蛋白和来自高尔基体的膜样结构。当病毒粒子成熟时，整个囊泡与宿主细胞膜相融合，囊泡中的病毒粒子即被释放于细胞外液中。病毒在细胞内的装配与成熟似乎是在完全隔离的状态下进行的，因此细胞功能不受影响。病毒增殖开始于病毒与细胞表面特异受体的结合。每平方微米的鸡胚成纤维细胞和仓鼠肾细胞的表面可以吸附20～200个SINV粒子，也就是每个细胞可以吸附105个病毒粒子。吸附以后，病毒核衣壳因病毒囊膜与细胞胞浆膜融合而侵入胞浆内，也可借助细胞的胞饮作用进入细胞。随即发生病毒RNA的复制与转录，在RNA转录后由26SRNA翻译出结构蛋白质。甲病毒的成熟包括以下几个步骤:①在细胞胞浆膜上出现病毒糖蛋白；②病毒核衣壳与已被改变了性质的胞浆膜的内面结合；③核衣壳通过已经改变了性质的细胞表面出芽。

 

6.抗原性甲病毒各成员的核心蛋白有非常相近的抗原性，在荧光抗体染色、ELISA、放免检测和补体结合试验等血清学反应中常出现交叉反应现象。而甲病毒的囊膜糖蛋白的抗原性却有明显的差异,这是鉴定甲病毒种类及其亚型的分子基础，通常采用中和试验和改良的血凝抑制试验加以鉴别。如采用动态血凝抑制试验可以容易地区分委内瑞拉马脑炎病毒的亚型，也可以鉴别不同地理位置的东方型马脑炎病毒毒株。病毒的血凝活性主要与囊膜糖蛋白E1有关，中和反应主要与E2有关。甲病毒成员间的氨基酸序列同源性，在变异较大的结构蛋白约40%；在非结构蛋白约60%。甲病毒与风疹病毒没有血清学上的交叉关系，序列分析没有发现二者的结构蛋白有相似的氨基酸序列。甲病毒具有凝集鹅、鸽和新生雏鸡红细胞的能力，但血凝素易于失效，且血凝反应发生在较窄的pH范围内。因此，控制和保证一定的pH以及防止病毒抗原失效，是进行这类病毒血凝反应的主要条件。必须指出，交叉反应的程度，不仅与免疫血清的种类、效价及其制造方法有关，而且与毒株本身和试验条件有关。

 

7.抵抗力稀释的福尔马林(0.2%～0.4%)、紫外线和60℃加热，均可在短时间内使病毒灭活。由于有囊膜，故甲病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂敏感。甲病毒对胰酶有抵抗力。丙酮似乎只能破坏病毒外膜，核衣壳几乎不受影响。因此，应用蔗糖丙酮法制备的血凝素抗原通常依然具有感染性。冷冻干燥是最理想的病毒保存方法，病毒活力可以维持5～10年以上。迅速冷冻，并保存在-70℃，也是保存病毒的良好方法。50%的甘油缓冲盐水有较好的保存作用，如置普通冰箱的小冰匣内(-10℃)，病毒可保持活力3～6个月。新鲜的感染组织(如鼠脑)保存在-10℃温度中，最好不超过一个月。病毒对酸敏感，所以实验室内常用1%盐酸溶液作为玻璃或塑料器材的消毒液。病毒在pH8～9的环境中最为稳定，病毒悬液和组织培养液中的蛋白质对病毒具有良好的保护作用。故在配制病毒悬液时一般应用pH8.0以上的缓冲液或再加入脱脂牛奶、灭活兔血清或白蛋白作为保护剂。

 

8.病毒进化对一些甲病毒进行的核苷酸序列测定、氨基酸序列比较和系统树(phylogenetictree)分析表明，甲病毒是从一个共同的病毒祖先进化而来。这一病毒祖先存在于数千年前，可能是一种昆虫病毒。甲病毒在自然界中的进化速度比较缓慢,如西方型马脑炎病毒(WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)和盖他病毒在一定的地理环境中，它们的遗传特性在较长一段时间内是稳定的。序列分析表明，东方型马脑炎病毒(EEEV)北美毒株的结构蛋白基因序列在1933～1955年的22年中是相当保守的，同样，寡核苷酸指纹图分析表明EEEV的基因组RNA也高度保守，这些结果说明EEEV的进化速度也是很慢的。在进化过程中，EEEV分化为3个单谱系群(monophyleticgroup):北美群包括北美及加勒比分离的所有毒株;南美群包括巴西和秘鲁分离的毒株;阿根延巴拿马南美群包括阿根廷、圭亚那、厄瓜多尔、巴拿马、特立尼达和委内瑞拉分离的毒株。北美群的进化率约为每年每个核苷酸替换16×10-4次，阿根廷巴拿马南美群的进化率约为每年每个核苷酸替换4.3×10-4次。北美和南美群大约分化于1000年前，而2个南美群大约分化于450年前。在上千年的进化过程中，一种类似甲病毒的病毒祖先从旧大陆引入到新大陆或从新大陆引入到旧大陆，从而产生2个甲病毒群，一群为新大陆病毒(NewWorldviruses)，包括EEEV、WEEV和VEEV；另一群为旧大陆病毒(OldWorldviruses)，包括SINV、米德尔堡病毒(Middelbergvirus,MIDV)、ONNV、RRV和SFV。