黑穗醋栗组织培养和遗传转化一
录入时间:2009-7-1 15:08:49
来源：青岛海博
摘要：通过对不同激素质量浓度配比实验，建立黑穗醋栗茎尖高频再生体系。结果表明，Ms + 6-BA1.0mg/L + NAA 0.1 mg/L，培养基可高效诱导黑穗醋栗茎尖的分化，1 / 2 MS 培养基可快速诱导根的生成，形成再生植株。25 mg/L 卡那霉素可以抑制茎尖的分化，20 mg/L ，卡那霉素可以抑制分化小苗的生根。利用农杆菌介导法将osMAPK4 基因转化黑穗醋栗，获得了抗卡那霉素的再生植株。提取转基因植株基因组DNA ，进行PCR 检测，结果表明。，MAPK4 基因已经被整合到黑穗醋栗基因组中。
关键词：黑穗醋栗；组织培养；遗传转化
黑穗醋栗，又名黑加仑，黑醋栗，黑茶蔺子，为虎耳草科茶蕉子属小灌木，是东北地区广泛栽培、营养丰富、风味独特、资源雄厚的北方浆果。其钙含量为水果之冠，维生素C 的含量比一般水果高出几十至几百倍，其含有的类黄酮有延缓衰老、增强人体免疫力、降血脂、改善动脉硬化和防癌抗癌的作用。但黑穗醋栗属于多年生木本果树，世代周期长，杂合性高，许多重要经济性状属于多基因控制的数量性状，遗传机理不明，利用常规的方法进行品种选育困难重重。利用基因工程手段将外源基因导入作物中，培育出新的品种已成为现代农业和农作物育种的发展方向。但是黑穗醋栗属于木本果树，离体培养技术还不完善，再生有困难，常常无法获得再生植株，并且缺乏高效的遗传转化方法。针对以上问题，我们以黑穗醋栗为试材进行组织培养和遗传转化的初步研究，以期为黑穗醋栗组织培养和遗传转化提供一定的依据。
1 材料和方法
1.l 材料
以黑穗醋栗品种布劳德（Brodtorp）茎尖为转化的外植体，取自东北农业大学园艺试验站。实验使用根癌农杆菌菌株LBA4404 ( Rifr , Kmr ) ，由东北农业大学生命科学学院植物生物工程研究室提供，质粒载体pBME12 含有osMAPK4 基因，PE12 启动子，及NPTⅡ基因，质粒图谱见图1 。
1.2 方法
1.2.1 黑穗醋果茎尖再生体系的建立
采取越冬前至早春萌芽前la 生枝条上的腋芽作为外植体，首先将带芽茎段用流水冲洗干净，然后在超净工作台上按下列程序消毒：70 ％酒精305 " 0.1 ％升汞15 min 一无菌水冲洗4 一5 次，除去叶芽外层苞片拨取0.2 mm 左右的茎尖。
将茎尖接种于附加不同激素的MS 培养基上诱导萌芽。每处理接种60 个芽，3 次重复，培养30d 后将培养茎尖转至增殖培养基，待苗高约2 一3 cm 时，再分别转人生根培养基生根，每处理接种60 个芽，3 次重复。培养温度为（25 士2 ）℃ ，光照强度2000lx ，每天光照12~ 14h 。
1.2.2 农杆菌介导法对黑穗醋果茎尖的遗传转化
将茎尖外植体放于分化培养基上预培养ld ，然后放于转化用的菌液中，浸泡15~20min。用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，然后转至MS 固体培养基上，28 ℃ 共培养3d ，共培养pH 值为5.2 。共培养后，用含有拍100 mg/L，阿莫西林的MS 液体培养基冲洗，离心去上清，用无菌滤纸吸干植物材料表面液体，转至含有100 mg/L 阿莫西林的MS 培养基上除菌。每7d 继代1 次。将除菌2 次以后的植物材料转至含有100 mg/L阿莫西林的MS 固体培养基上继续进行转化筛选及除菌。2 周继代1 次，并同时诱导抗性植株。对抗性植株进行PCR 检测，用osMAPK4 基因序列的引物进行PCR 检测，引物如下：
sense : 5 ' AAGCTYGCCATAGATFCAATYCAATC 3 '
antisense : 5 ' GATCCAAACCAAAGCTTTTTTTCTTTCC3 '
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