猪水疱病病毒-肠道病毒属(Swine vesicular disease virus) 猪水疱病是近30年来新发现的一种猪的疫病。1966年10月首先发现于意大利Lombardy的猪群 中，认为这是一种在临床上与口蹄疫具有相似症候群的疾病。该病同时发生在两个猪场，都 因从同一来源引进猪而发病。意大利的Brescia口蹄疫研究所和英国的Pirbright动物病毒研 究所进行了一系列检验，都未能证明有口蹄疫病毒的存在，但发现一种肠道病毒，因此一致 认为这是不同于猪口蹄疫、水疱性口炎和水疱疹的一种新的猪的水疱性疾病。这些疾病虽然 临床上相似，但可通过病原的理化学特性鉴定、动物接种和血清学等方法加以鉴别(见表16 - 11)。香港地区随后也发现猪水疱病。Mowat、Darbyshire和Huntley等报道(1972年)， 于1971年4月在香港新界一些农场中发现危害于猪的一种疫病，发病率比口蹄疫低，病情也 较温和，通常不引起死亡。经检验，香港地区的病毒与口蹄疫无关，而与意大利1966的病 毒相似，因此确认香港的猪水疱性疫病，也是由猪的一种肠道病毒所致。
英国从1972年12 月到1973年4月发生89个水疱病疫点；随后猪水疱病又发生于波兰(1972年)、奥地利(1972年 )和法国(1973年)。意大利于1972年10月重新暴发。以后在比利时(1973)、前西德(1973年) 、 东欧一些国家(1972年冬至1973年春)、瑞士(1974年)和荷兰(1975年)等国也相继发生了猪水 疱病。日本于1973年12月第一次在三个县的15个猪场内发生猪水疱病。由于在欧洲的许 多国家相继发生猪水疱病的流行蔓延，引起了世界肉食市场的混乱，1973年1月国际兽疫局 对此极为重视，专门召开会议，研究措施，制定条例，并在这次会议上正式定名为“猪水疱 病”。猪水疱病引起严重的经济损失，以英国为例，1972年至1973年扑杀、销毁42814头 猪 ，价值100万英镑，1972年至1974年仅赔偿费一项就花费440万英镑。
1、形 态特征 水疱 病病毒在电子显微镜下呈球形，超薄切片中的病毒粒子的直径为22～23nm，磷钨酸负染法测 定为28～30nm。Liebermann等测定病毒粒子的平均直径为251±10nm，由裸露的二十面 立 体对称的衣壳和含有单股RNA的核心组成。在负染标本中，可见衣壳由许多空的圆筒形壳粒 构成。水疱病病毒在细胞胞浆内复制，成熟的病毒粒子经常呈晶格状排列，在发生病变的 细胞的胞浆空泡膜内凹陷处形成特异的环形串珠状排列。这种特异的排列结构在病变中期的 宿主细胞内是能经常见到的，偶而也可在一个细胞内同时看到病毒的晶格状排列和环形串珠 状排列。串珠状排列的病毒粒子的形状与大小非常均一，呈圆形，大小与晶格排列的病毒粒 子完全一致。在感染的仓鼠肾细胞培养物中，还常可以见到由纤维样结构包围起来的小体 ，小体内充满着病毒粒子。
2、理化学特性 水疱病病毒的 沉淀系数为150±3S，分子量为 104×106Da。关于水疱病病毒的结构蛋白，Delagneau等应用1％十二烷基 硫酸钠(SDS)和05mol/L尿素缓冲液100℃加热一分钟的方法，使病毒裂解，随后在聚丙烯 酰胺凝 胶中进行电泳，发现水疱病病毒粒子及空衣壳中有分子量分别为38 000和30 000 Da的两 种 多肽存在。空衣壳体的电泳图像分成VP1及VP2两个峰，但完整病毒粒子的两个峰并不完 全分开，在VP1和VP2两峰之间有轻度的重叠。水疱病病毒的电泳泳动能力不同于口蹄 疫病毒，水疱病病毒的VP1比口蹄疫病毒的VP1泳动得远，VP2也比口蹄疫的VP2泳动 略远。估计水疱病病毒VP1的分子量在37 000～39 000 Da之间，VP2的分子量在29 00 0～ 31 000 Da之间。根据猪水疱病病毒在氯化铯中的浮密度，又有浮密度为134g/ml的“ 轻 组分”以及浮密度为144g/ml的“重组分”两种。约有98％的感染力寓于“轻组分”中。 “ 轻组分”和“重组分”都有相同的RNA和蛋白质比例以及相同的多肽成分。在病毒复制过程 中，每一种成分又都产生同样比例的“轻”、“重”两个组分。水疱病病毒的“轻”、“重 ”两种组分在酸性环境条件下都具有稳定性，不受pH30的影响，“重组分”的颗粒大小为 282±076nm，“轻组分”的颗粒大小为301±074nm，略大于“重组分”。在刺激机 体产生血清中和抗体的能力上，“重组分”的效力低，“轻组分”的效力高。尚未发现猪 水疱病毒有凝集红细胞的作用。
3、抵抗力 水疱病病毒抵 抗乙醚和氯仿。1mol/L浓度的MgCl 2明显提高病毒在50℃的稳定性。水疱病病毒在pH50、 40和30时皆稳定。据Hern iman 氏的报道，病猪粪便和血液中的水疱病病毒于pH39～96和5℃温度下，可以存活164天， 不 丧失其感染性；但pH值低于288及高于1076时，则在164天后失去感染性。60℃2～10分 钟 可使病毒灭活。 粪便中的 病毒在环境温度为12～17℃时，可存活138天；但当环境温度为25℃时，约28天病毒就被灭 活。动物尸体在-20℃经11个月仍有大量感染性病毒存在。2％氢氧化钠溶液在25℃ 作用24 小时，使水疱病病毒灭活，但在0～4℃24小时，则尚不能灭活病毒。其它如5％氨水、3％福 尔马林，都可杀灭病毒。1％过氧乙酸和次氯酸钠能在短时间内杀灭水疱病病毒。细胞培 养的病毒液在37℃下经144小时失去对细胞的致病变作用。用福尔马林加氧化剂于25℃左 右温度下薰蒸密闭的厩舍18～24小时，可以达到消毒目的。
4、增殖 应用原代仔猪肾细胞以及IBRS2、PK15和人羊膜传代细胞FL等培养猪水疱病病毒，都 可产生明显 的细胞病变：细胞变圆，固缩而呈颗粒状，聚集成堆或散在。这些病变一般出现于接种病毒 后30多个小时。适应株甚至可在接种后10小时左右引起细胞病变。猪水疱病病毒易在IBRS 2传代细胞上复制增殖，IBRS2细胞似乎对猪水疱病病毒特别敏感，每ml病毒液可达2×1 09个蚀斑形成单位。蚀斑呈圆形，边缘整齐，通常在接种病毒后20小时开始出斑，48小时 的蚀斑直径为30mm左右，72小时可达60mm。水疱病病毒对牛源细胞培养物(如原代犊 牛肾细胞、原代犊牛甲状腺细胞)和BHK21细胞不引起细胞病变。对原代鼠胚细胞和HeLa细 胞系能否产生细胞病变，报道尚不一致。某些水疱病病毒株较难适应原代仓鼠肾细胞，初 代感染接种时不出现细胞病变，但经检验却确有病毒存在。需传到20代左右时才能出现规律 性的细胞病变。另外一些毒株较易适应原代仓鼠肾细胞，并产生比较明显的细胞病变。水 疱病病毒感染的细胞培养物，在用免疫荧光抗体检查时，可在病毒接种后3～5小时，就在胞 浆内看到显示荧光的颗粒，这表明在胞浆内此时就有病毒成分的产生。原来认为水疱病病 毒和口蹄疫病毒在细胞培养中存在干扰现象，但是后来证明，在同一细胞培养物中同时或先 后接种二种病毒，都能产生较高的病毒滴度。
5、病原性 猪水疱病病毒除对本动物(猪) 引起感染发病外，对其它家畜、家禽，如奶牛、水牛、黄牛、绵羊、山羊、马、驴和鸡等均 不引起发病。病猪发热(41～42℃)，并于鼻镜、蹄冠、蹄球和趾间皮肤上出现水疱。水疱直 径1～3cm，常在2～3天内融合和破溃，并迅速愈合。皮下或皮内注射感染组织浸液或水疱液 于蹄球或蹄冠部，常可在36小时内于接种部或其周围出现水疱。此后迅速发展为全身感染， 并于趾间、鼻镜和舌上出现水疱。实验动物，如2～3日龄的乳鼠和1～2日龄的乳仓鼠、吮 乳大白鼠都能感染发病。乳鼠表现特异的麻痹症状：四肢后伸，强直。初代分离时病程较长 ，小鼠在感染后5～6天死亡，用1045TCID50滴度以上的病毒腹腔接种乳鼠， 于接种后3～8天内引起麻痹死亡。7日龄以上的小鼠大多具有抵抗力。幼龄家兔不感染。多 数学者认为水疱病病毒不能引起豚鼠发病，但有人用跖部皮内穿刺接种法强迫适应，据云几 代后可以使跖部出现轻度的水疱性炎症。水疱病病毒不感染鸡胚。
6、抗 原性 猪水疱 病病毒同口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒和水疱疹病毒没有交叉免疫反应，四种病毒虽然都使 动物产生相似的临床症状，但抗原性不同。有人应用补体结合试验研究猪水疱病毒各毒株 之 间的关系，将英国／1972、意大利／1966、法国／1973及香港／1971等4个毒株作交叉补结 试验。从测定它们的R与r值的关系来看，4个毒株之间仅有微小的差异，这个差异同口蹄疫 亚型之间的差异值类似。在中和试验中，意大利／1966株、香港／1971株和法国／1973株彼 此不同，且与意大利／1972、英国／1972、澳大利亚／1973和波兰／1973群毒株不同。琼脂 扩散试验也证明几个毒株之间存在一些差异。应用RNase T1单向PAGE技术对不同时间、不 同地 区分离的8株水疱病病毒进行比较，发现其可以大致分为三组，但均与日本／86参考株存在 差异。曾对不同地区的流行毒株进行猪体交叉免疫试验，结果几个地区的毒株没有表现出 太大的差异，互相能够交叉免疫。Graves等(1976年)首次报道了猪水疱病病毒与人的一种 肠道病毒 柯萨奇病毒的关系，并且推测这种病毒可能是由人传给猪的。该氏用抗 柯萨奇病 毒的血清对猪水疱病病毒进行中和试验，结果证明，无论是在细胞培养物上或于小鼠脑内接 种时，猪水疱病病毒都可被柯萨奇B5型血清所中和。另外，以B5型柯萨奇病毒和猪水 疱病病猪的康复血清进行中和试验，以PK15细胞为指示细胞，也都出现明显的交叉中和现 象。人的B5型柯萨奇病毒经用各种方法感染猪，都不引起临床症状，但在猪体内却可产 生高效价的中和抗体，这说明病毒在猪体内是有活性的。迄今尚未见有人类感染猪水疱病 的报道，但与水疱病病畜有接触史的人或在实验室内进行此项工作的人，体内确能查到高效 价的水疱病病毒的中和抗体。猪水疱病病毒和B5型柯萨奇病毒之间的上述血清学关系， 似可说明猪水疱毒病毒在人与猪之间传布的可能性。因此有人断言：猪的水疱病病毒很可能 就来源于人。Brown等(1976年)通过血清学和RNA杂交试验发现近期分离的B5型柯萨奇 病毒8068株、9954株与原始Faulkner毒株有着明显的差异；而水疱病病毒与Faulkner毒株之 间的关系却比上述二株B5型柯萨奇病毒株与Faulkner毒株之间差异要小。Harris等(1 975年)也对猪水疱病病毒和B5型柯萨奇病毒的多肽成分与抗原差异的关系进行了研究。通 过RNA杂交试验，发现水疱病病毒与原始的柯萨奇B5型(Faulkner)毒株，大约有50％的同 源性，而原始型柯萨奇病毒与后来分离的柯萨奇病毒株(如8068株、9954株)的RNA也有较大 差异。这说明后来分离的毒株已经有了某些改变，而且水疱病病毒与柯萨奇病毒二者之间有 着比较密切的亲缘关系。用35S蛋氨酸或3H氨基酸标记的水疱病 病毒和B5型 柯萨奇病毒，混合后在15%～45％(重量／体积)的蔗糖密度梯度中作离心沉淀试验，结果也 发现两种病毒的沉淀系数相似，而在氯化铯中的浮密度二者也相同 134～135 g／ml。用 十二烷基硫酸钠(SDS)裂解病毒粒子，再作聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见水疱病病毒和B5型 柯萨奇病毒的多肽图形不同，但各国在不同时间分离的水疱病病毒之间的多肽图形也有显著 不同。由个别地区分离的水疱病毒株(如法国1／73)，其多肽图形很像近期分离的B5型柯 萨奇病毒。
7、传播 病猪的病变上皮组织和水疱液中含有 高效价的病毒，也可由淋巴结 、骨髓、扁桃体、肝脏和血液中分离到病毒，但含毒量较低，且较快消失。肌肉中的病毒含 量不高，但也曾有由患病后15天左右的病猪肌肉中分离到病毒的报道。病猪可由鼻腔 和 口腔排毒，持续10天左右，也可随粪排毒6～12天。曾有尿亦含毒，且能直接致死1～3日龄 乳鼠的报道。猪水疱病的主要传播方式是直接接触感染。当健猪与病猪或带毒猪同居混群 饲养，或用污染的饲料、泔水喂猪时，使健康猪感染发病。病毒可经损伤的皮肤直接侵入机 体到达敏感部位 蹄、鼻镜和口腔上皮组织，并形成特征性的水疱；也可经口感染 ，从消化 道经血液到达敏感部位产生水疱。猪水疱病的流行无严格季节性。当猪只调动频繁，大量 集中，气候变冷时，发病率增高，达50％～90％。农村一家一户饲养的猪的发病率较低。 猪水疱病病毒的传播力不如口蹄疫病毒，所以流行比较缓慢，不呈席卷之势。鼻镜上出现水 疱的猪也不如口蹄疫多。英国在1972～1973年猪水疱病流行期间，发现本病的传播主要通 过三个途径：(1)用屠宰场病猪的残屑或下脚料喂猪；(2)买进病猪，直接传播；(3)用污染 的交通工具运猪。被水疱病病毒感染的母猪所生的2～3日龄的仔猪也可发生感染，出现水 疱。野猪也被感染，呈现与家猪相同的症状。Sasahara等(1980年)从健康猪的粪便中分 离获得1株可被水疱病免疫血清中和的病毒，因此认为猪群中可能存在隐性感染。
8、免 疫 动物在自然感染水疱病后4天即在血液内出现一定滴度的中和抗体，且 能持续较长时间 。恢复动物可产生坚强的免疫力。人工免疫接种也有良好的免疫效果。(1)弱毒疫苗① 鼠 化弱毒苗：系将自然流行的猪源强毒连续通过2～3日龄乳鼠30代以上而减毒育成的。病毒滴 度(LD50)一般可达10-70左右。制苗时应用30％甘油盐水制备成感染乳 鼠肌肉 组织苗。免疫剂量为1∶100～500倍2ml。注射幼猪，应不引起临床症状，攻毒时保护力应 在8 0％以上。免疫持续期可达6个月。此苗可与猪瘟兔化弱毒疫苗共用，不影响各自的效果。 ②细胞培养弱毒疫苗：系用原代仔猪肾细胞培育的弱毒株，病毒在接种后20～30多小时产生 中等度明显的细胞病变，病毒滴度(TCID50)可达10-70～10- 80。一般 经40、50代致弱，但也有需经70代以上才能致弱的。组织培养弱毒苗对猪可能产生轻微反应 ，但不引起同居感染，是目前安全性较好的弱毒苗。但个别毒株在连续传100代以上也不明 显致弱，接种后还可引起同居感染，毒力迅速返祖。细胞培养弱毒疫苗的免疫保护率多在80 ％以上，免疫期可达4～5个月。细胞培养物中加入20～30％的甘油，可以提高疫苗的保存期 。也有应用仔猪睾丸细胞、胎猪肾以及仓鼠肾细胞或IBRS2细胞驯化培育 的弱毒疫苗株 。一个理想的弱毒疫苗株，应该既能在动物体内增殖，但又不能产生组织损伤，且在敏感 动物体内多次传代后，继续保持稳定特性。遗憾的是，经上述途径驯化培育的几个弱毒疫苗 株，均未完全符合这样的要求，实际应用中暴露出了许多弊病，目前已经基本停用。(2) 灭活疫苗细胞培养灭活苗:原代仔猪肾细胞、仓鼠肾细胞和IBRS2传代细胞均可用于疫苗 生产。细胞培养物的病毒滴度,TCID50为10-75左右,乳鼠LD50为10 -60以上。用最终浓度为01％的甲醛或006％的β丙内酯或005％的乙酰乙烯亚 胺(A EI)作为灭活剂。应用二乙烯亚胺(BEI)的效果更好。于4℃、26℃或37℃灭活6～24小时。佐 剂可用氢氧化铝、油乳剂或氢氧化铝皂素。疫苗安全可靠。注射量为3～5ml,注苗后7 ～10天产生免疫力。免疫保护力在80％以上。注射后4个月仍有坚强的免疫力。(3)被动免 疫 高免 血清在应急情况下,可以应用自然发病后痊愈的猪血清,也可应用人工制备的猪高免血清, 作紧急预防接种。如果配合其它安全防制措施,可获良好效果。康复猪血清一般采自自然痊 愈后一个月的 猪,血清中和效价应在log35～40以上。每头猪注射4～8ml。自然痊愈康复后1个月的 猪 ,再经一次人工攻毒 1∶5病毒液40ml多点注射。攻毒后15天采血,血清中和效价可 达log55。 每公斤体重注射02ml,可获得良好的被动免疫力。免疫期达30天。在饲养期短,周转快, 调 动频繁的商品猪群中,合理使用高免血清的被动免疫方法,常可达到预防本病的效果。
9、 诊断 猪水疱病在临床症状、病理剖检变化上很难与口蹄疫等水疱性疾病相 区别,所 以诊断本病的主要着眼点就是将其与口蹄疫等疾病进行鉴别,请参阅表16-11。(1)病 毒分离: 采取病猪的水疱皮,洗净、称重并研磨后,用生理盐水或磷酸盐缓冲液制成1 ∶5～1 ∶10悬液,置4℃浸出一夜或在室温浸出4小时。振荡混合后,以3 000r／min离心沉淀10分钟, 其上清液即为待检病毒液。颈部皮下接种2～3日龄的乳鼠或乳仓鼠,或者IBRS2 、PK15等猪 肾传代细胞。一般在最初1～2代内即可引起感染,实验动物发病、死亡,或使组织培养细胞出 现细胞病变。如果初代分离呈阴性结果,应继续盲传2～3代。(2)中和试验:中和试验是 诊断猪水疱病的常用方法,较易得出确切的诊断结果。①用已知血清鉴定未知病毒:选用2 ～3日龄的乳鼠,每窝10只,各以1只母鼠哺乳。分别注射已知的猪水疱病免疫血清和口蹄疫各 型免疫血清。每窝注射7只,留3只不注射,作为病毒对照。注射的猪水疱病免疫血清不稀释, 口蹄疫血清测作1:4稀释。每只颈背部皮下注射01ml。于注射血清后18～24小时,接种如 上制备的待检病毒液。于每窝注射过血清的7只乳鼠中,5只接种病毒液,留2只作为血清健康 对照。3只未注射免疫血清的乳鼠,也同时接种病毒液。每只颈背部皮下注射01ml。接种 病毒后,每天观察2～3次,连续观察6天。如注射猪水疱病免疫血清的乳鼠被保护,血清对照鼠 均健活,病毒对照鼠和注射各型口蹄疫免疫血清的乳鼠均发病死亡,则被检病料为猪水疱病 病 毒,而不是口蹄疫病毒。②用已知病毒鉴定未知血清:于待检血清中每ml加青、链霉素各1 000单位,室温处理1小时,或4℃处理4～5小时。选用2～3日龄乳鼠,每窝10只,各以1只母鼠 哺乳。以如上处理的待检血清注射,每窝7只,留3只不注射作为病毒对照。每只乳鼠颈背部皮 下注射01ml。于注射被检血清后18～24小时,用猪水疱病病毒及口蹄疫各型病毒进行接 种 。每一病毒接种一窝乳鼠。在每窝注射过被检血清的7只乳鼠中,给5只接种病毒,留2只作血 清健康对照。未注射血清的3只乳鼠也同时接种病毒。每只乳鼠颈背部皮下注射01ml病毒 液(10-2～10-3稀释,约含10 000LD50)。攻毒后观察6天,每 天观察2～3次 。如果接种猪水疱病病毒的乳鼠被保护,血清对照乳鼠健活,而猪水疱病病毒对照鼠以及用各 型口蹄疫病毒攻击的乳鼠均发病死亡,则被检血清中含有猪水疱病抗体,而不含有口蹄疫病毒 抗体 。必须指出,由于口蹄疫和猪水疱病的广泛存在,同一份血清中可能同时具有抗口蹄疫抗体和 抗水疱病抗体。(3)反向间接红细胞凝集试验:一般应用丙酮醛甲醛法或戊二醛 甲醛法 固定绵羊红细胞,并以提纯的豚鼠抗水疱病IgG致敏,制成水疱病红细胞诊断液。IgG的最适浓 度为50～100μg／ml,致敏过程在pH40的01mol/L醋酸缓冲液内进行。具体操作方法请参 阅本书 第十四章有关节段。水疱病红细胞诊断液在4℃可以保存5个月。 试验在微量 滴定板上进行。先将被检材料(如水疱皮)用pH72, 011mol/L磷酸盐缓冲液或生理盐水 洗 净,称重后研磨,作成1∶3悬液,如上浸出制成待检抗原。随后将其在小试管中用内含1％兔血 清、005％聚乙二醇(分子量12 000)和01％叠氮化钠的pH72,01mol/L磷酸盐缓冲液 作倍倍稀释 ,自1∶6、1∶12……1∶768。于微量滴定板的第一排1～8孔内分别滴加8个不同稀释度的 待检抗原,每 孔2滴。第9孔滴加稀释液2滴,作为阴性对照。第10孔滴加水疱病标准抗原1:30稀释液2滴,作 为阳性对照。随后于1～10各孔内滴加水疱病红细胞诊断液1滴,轻轻摇震滴定板,使红细胞 均匀悬浮后,置室温下感作15～20小时后判定结果。有两孔出现++以上凝集现象者,即 可判为 水疱病,但阴性对照孔应不凝集,阳性对照孔应凝集。红细胞凝集++以上的抗原最高稀释度 ,即为该被检抗原的效价。反向间接红细胞凝集试验虽然灵敏度较高,但个别被检抗原可能 在 低倍稀释孔内出现非特异凝集现象。必要时,应以正常对照豚鼠的IgG同样致敏已固定的绵羊 红细胞,制成对照正常红细胞诊断液。试验时,将待检抗原如上稀释后同样滴加于微量滴定板 的第1排和第2排的1～8孔内,第9和第10孔仍为阴性、阳性对照。随后于第1排各孔内加入水 疱病红细胞诊断液,第2排各孔内加入对照正常红细胞诊断液。如上感作、判定。比较第1排 和第2排的凝集情况,根据两排凝集滴度之差进行判定,以相差两孔以上者为阳性。(4)免疫 荧光抗体法:将猪水疱病的水疱皮浸出液接种细胞培养物,随后用荧光抗体鉴定细胞内的病 毒抗原。方法是在培养于飞片上的IBRS2、PK15或原代仔猪肾细胞单层上接种如上制 备的1∶10水疱皮浸出液02ml,吸附并补加维持液后,37℃孵育,经不同时间后取出飞片,以- 20℃甲醇固定30分钟,晾干后,滴加20倍稀释的豚鼠抗水疱病免疫血清02ml,37℃感作30分 钟,用PBS充分冲洗后,再加荧光素标记的兔抗豚鼠IgG，37℃染色30分钟。经PBS充分冲洗后, 晾干,镜检。应用大孔培养板培养细胞,直接接种水疱皮浸出液后,如上荧光染色,当然更为方 便。同时设猪水疱病病毒阳性和阴性对照培养物以资比较。阳性病料于接种后5小时开始 出现荧光细胞,并随时间的延长,荧光细胞数增多。但如病料中的病毒含量低,则常推迟至接 种后10～24小时才能检出阳性细胞。也可应用荧光抗体直接染色法,其与间接法的检出结 果相 似。应用荧光抗体直接检测病料,如水疱皮,效果常不理想。猪水疱病病毒和口蹄疫病毒在 荧光抗体检查时不发生交叉反应。(5)补体结合试验:一般应用微量补体结合试验,各成 分的用量为0025ml。试验在微量滴定板中进行。添加溶血系统之前,置37℃感作结合1～4 小 时或4℃18小时。后者的检出率略高于前者。将水疱皮等被检病料如上作成浸出液后直接 检 测。(6)酶联免疫吸附试验(ELISA):检测病料或细胞培养物中的病毒抗原,一般应用双抗 体夹心法:应用提纯的猪或豚鼠高免血清(见“附”)IgG,包被40孔酶标板,作为固相载体;随 后滴加被检抗原,感作并冲洗后,用含10％马血清的PBS液封闭,37℃感作并冲洗后,再加酶标 记的同源(猪或豚鼠)高免血清IgG,即酶结合物。再经感作和冲洗,最后加入底物显色,测定O D值进行判定。有人应用抗水疱病病毒的单克隆抗体制备酶结合物,据云检测效果更为理 想。也可应用琼脂扩散试验和放射免疫测定等诊断方法,请参阅本书第十四章有关内容。 附:猪水疱病豚鼠高免血清的制造 1、抗原制备 选用抗原性良好的猪水疱病乳鼠 适应毒,接种乳鼠,待其发病濒死时采取感染肌肉组织,在磷酸盐缓冲液或生理盐水中研磨成1 ∶2～1∶3悬液。于4℃浸出过夜,3 000r／min离心沉淀10分钟,吸取上清液。病毒滴度(LD 50)需在10-7以上。保存于4℃冰箱内备用。 2、免疫注射方法 选用体重在500g左 右的健康豚鼠10～15只,免疫注射4次,各次间隔4～5天。方法和剂量如下:第一次 两后肢 脚掌穿刺接种04ml,皮下06ml;第二次 皮下注射15ml,肌肉注射05ml(加 05％皂素); 第三次 皮下注射30ml,肌肉注射15ml(加05％皂素);第四次皮下注射60ml。于最 后一次注射后的第10～12天,心脏采血,分离血清。56℃灭活30分钟后,加防腐剂,分装备用。 3、效价测定 将血清作成1∶5、1∶10、1∶20、和1∶40稀 释液,分别注射2～3日龄乳 鼠7只,每只颈背皮下01ml。18～24小时后用10-2稀释的猪水疱病病毒攻击。同时设 血清对 照和病毒对照各2只。观察6天。血清的保护效价应在1∶5以上。血清效价远较康复猪血清为 低,可能是豚鼠对水疱病病毒比较钝感的缘故。 4、特异性检查 将血清作1∶5稀释 ,注射5窝乳鼠,每窝注射7只,每只颈背部皮下01ml。18～24小时后分别用10-2～10 -3 的口蹄疫各型病毒和水疱病病毒攻击,每只颈背部皮下注射01ml。另设血清、病毒对照各2 只,观察6天。如果血清对照乳鼠健活,而以各型口蹄疫病毒攻击的乳鼠均发病死亡,以水疱病 病毒攻击的乳鼠被保护,即证明血清的特异性良好。
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