变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)能 够清晰地分辨仅差别1个碱基的单链寡聚核苷酸。核酸序列测定技术就是在这种高分辨率变性PAGE技术的基础上建立起来的。目前有二种快速的DNA测序方法:酶促法和化学降解法。虽 然其原理大相径庭,但它们都需要使待测DNA片段转变成一系列标记的单链寡聚核苷酸,这一 系列寡聚核苷酸均有一个固定的5末端(起始端),但3末端(终止端)长度不同，形成一系列只相差1个核苷酸碱基的连续末端。它们是通过分别终止于DNA链上不同位置的A、T、C和G 碱基这4种反应体系来制备的。这4种反应生成的单链寡聚核苷酸。在变性PAGE中上样于相邻 的加样孔，电泳后就可以读出被测DNA链的碱基组成顺序了。下面主要介绍酶促测序法，也就是常用的双脱氧末端终止法。其原理类似于DNA聚合酶合成和延伸DNA链的过程，只要在新的DNA链合成过程中，加入一种特殊的底物 双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)，它的5 端能正常连接到上一个核苷酸的3端，形成磷酸二酯链，但它的3端羟基因脱氧而不存在 ，所以不能与下一个核苷酸的5端形成磷酸二酯键连接。当正常DNA合成过程中，掺入这种 ddNTP，新DNA链的延伸也就终止于此。因而在4种反应体系中，分别加入4种不同的双脱氧核 苷酸，即ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP。由于ddNTP是随机掺入的，于是4种反应体系中，新 DNA链的延伸可随机终止于任何位置的A，T、G或C碱基，最后得到一系列仅差一个碱基的单 链寡聚核苷酸。双脱氧末端终止法的主要步骤包括： 1、模板DNA制备  通常将待测病毒DNA或cDNA片段(病毒RNA的反转录产物)重组到M13噬菌体或高拷贝质粒，如pUC系列等，获得病毒核酸片段的克隆。或者用PCR大量扩增待测片段。然后采用碱变性法将双链DNA变性为单链DNA模板； 2、退火反应  加入人工合成的引物 ，与模板DNA待测区域退火； 3、延伸标记反应  加入4种dNTP，其中一种 为放射性同位素标记的dNTP,常用α 32P dATP或α 32 P  dCTP(如果引物5末端已预先标记，则不用)和DNA聚合酶，常用T7测序酶和 Taq  DNA聚合酶(作者经验表明，前者的测序效果 更佳)，延伸标记大约5分钟； 4、延伸终止  将延伸标记物等 分4份，分别加入最适浓度的4种ddNTP，使延伸反应能够终止于所有可能发生的位置； 5、终 止反应  加入上样液终止上述反应，95～100℃变性3分钟，这样就产生出一系列大小 的放射性标记的单链寡聚核苷酸； 6、电泳分离  将4种反应产物上样于变性PAGE的相邻上样孔，用1 300～1 800V的高压进行电泳分离，然后放射自显影显现寡核苷 酸条带，最后直接读出所测定的序列。目前测序反应已标准化，许多生化试剂公司均有标准化的测序试剂盒销售，具体操作方法可按试剂盒的操作手册进行。一般24小时左右可完成 一次序列测定。DNA序列测定为深入研究基因的结构与功能奠定了基础，通过测序分析病 毒核酸的一级结构,对于了解病毒的结构和功能、病毒的复制、病毒的遗传与变异等有特别 重要的意义。测序是区别二种不同核酸分子最精确的方法，虽然把这一技术用于病毒诊断的 条件尚不成熟，但随着测序技术的进一步发展和自动化，它有可能成为鉴别和诊断病毒的最佳方法之一。

 

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