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电子显微镜技术的新发展



录入时间:2009-6-25 17:19:51 来源:青岛海博

  
  目前,用于生命科学研究的电子显微学发展有两个趋势。一是向更微细的结构,生物分子和原子水平发展。电镜已成为分子生物学、分子遗传学非常重要的研究工具之一,用于细胞生物学、生物分子结构与功能关系以及抗原、抗体、蛋白质、DNA定位等研究,例如对微管分子的研究、膜抗原的超微定位、膜抗原基因对核及细胞骨架系统蛋白质组成的影响、细胞核内DNA、组蛋白、非组蛋白的分子观察和定位以及核孔复合体识别蛋白质的观察等等,都取得了非常突出的进展。另一个重要趋势是向更普及的应用方向发展,如农林、医药、动植物学等。在应用方面最引人注目的是病理诊断电子显微学。它已成为一些病毒,如某些肿瘤和病毒病诊断上必不可少的工具。自从微波技术引入诊断电镜学以后,病理样品从取材到电镜观察只需2小时左右;免疫电镜、电镜组化等技术均已引入常规诊断学中。 
  1.扫描电镜向高分辨率与低电压方向发展。日本人Tanaka改进了常规的扫描电镜,设计了新型超高分辨率扫描电镜UHST1型,系统地改良了生物样品的制备技术,关键是免除了金属喷镀的基本制样过程,而用小而薄的样品,使用“导电染色”,如用醋酸铀水溶液浸染,以逐级乙醇脱水,在临界点干燥,以“抛光的碳平板”(polishedcarbonplate)作为样品的载体,在电压15KV条件下可以获得超高分辨的扫描电镜图像,达到优于08nm的分辨力。不仅可以分辨出核糖体的大、小亚基,并可见到串连于诸多核糖体之间的mRNA的纤细丝状结构,能看见DNA分子双螺旋结构及其大沟与小沟。这一进展令人鼓舞,它使生物大分子的三维图像直接展现在人们眼前。 
  2.电镜水平的原位核酸杂交为了提高核酸杂交的准确性与分辨力,不使用同位素放射自显影技术而使用胶体金标记技术。电镜原位杂交技术虽然早在1971年就开始有报道,随后不少科学家也进行了许多尝试,但都存在一个共同问题,就是样品精细结构保存的不好。直到1986年Binder等人用LowicrylK4M包埋样品,切片后进行杂交,才改进和提高了杂交的效率和结构的保存。1987年Webster等用与Binder相似的方法检测了细胞内mRNA的分布。Singer等则于1989年用双标记原位杂交技术同时检测细胞内与骨架结合的mRNA及其所表达的蛋白质。  Erickson使用链亲和素金标记物,以生物素标记cDNA为探针,多聚甲醛固定样品1小时,以二甲基甲酰胺脱水,用LowicrylK4M树脂包埋,在镍网上进行染色免疫反应。  
 3.高压电镜高压电镜主要用于两个方面。一是由于高压电镜对薄样品的辐射损伤小,因而可以获得薄样品的高分辨像;二是由于高压电镜的穿透力强,可以观察厚样品和含水样品(如活体微生物和病毒等)。厚样品如单层细胞,经固定、染色和临界点干燥后,结合立体观察可研究完整细胞的三维结构及其与功能的关系,已有不少学者进行了这方面的研究,并取得了一定进展。含水样品是放在高压电镜特制的充气小室内进行观察的,虽已有人进行了这方面的探索,但尚有不少技术问题有待解决。  
 4.X射线显微分析X射线显微分析(Xraymicroanalysis)是在电镜基础上发展起来的一项新技术。该技术特点在于:①既用电镜观察样品的超微结构,又能分析其微小区域内的化学元素,为研究样品的形态结构、组成成分与其生理功能的关系提供了条件;②可以分析小于1μm样品中的元素,其灵敏度可高达10-15~10-18g,这是其它分析方法难以实现的。该技术所用仪器包括分析型电镜、透射电镜、扫描电镜、扫描透射电镜加X射线显微分析装置以及专门设计的电子探针等。它的原理是在电镜内先以高速细电子束轰击样品表面的微小区域,使该区域所含元素各自发射出特征X射线,同时利用波谱仪(WDX)和能谱仪(EDX)查出特征X射线的波长和能量,据此可以了解该区域内元素的种类和含量。  X射线显微分析生物样品的制备最好运用冷冻制样法。样品经液氮和低温冻结后,可以保存细胞内的各种可溶性物质和电解质,有利于进行细胞生理及生化功能的研究。冷冻制样技术包括冷冻干燥、冷冻置换及冷冻超薄切片等。  
 5.电镜细胞化学是将细胞化学和电镜技术相结合的一项技术,是光学显微镜组织化学基础上的延伸与发展。该技术是将特定反应产物形成电子散射力强的不溶性沉淀物,借助电镜做超微结构的原位分析。由于细胞内酶分布和细胞超微结构二者密切结合,从而为探讨细胞的生理和病理状态提供了科学依据。此法无需对酶进行提取和分离,就能获得组织或细胞内有关代谢的大量信息,因此能将超微结构与功能反应有机地结合起来。目前,用该技术检出的酶大约有80种,近40种可进行超微结构定位。酶的电镜细胞化学技术大致操作步骤为:化学固定或冷冻切片、温育、锇化、脱水、树脂包埋、超薄切片、电子染色、电镜观察等。  
 6.扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(scanningTunnelingMicroscopy,STM)是近几年才发展起来的一种新型显微镜。STM利用量子力学中的隧道效应原理,可在原子尺度下研究物体表面的微观结构和电子态。1983年首次用STM得到了Si(111)7×7重构表面的原子分辨图像,为认识这个在表面物理中可能是最令人感兴趣而又最复杂的表面奠定了基础。STM不仅用于获得原子结构和电子态等对基础研究十分重要的信息,且已显露出在微电子工业、表面微加工、电化学、催化、分子生物学工程等许多领域中的应用前景。据不完全统计,全世界已有千余台STM。  STM的基本工作原理是让一个有效尖端是原子尺度的针尖在压电陶瓷管的驱动下,由反馈回路控制在被研究物表面上方零点几纳米处扫描,以获得表面信息。另外,由于隧道电流与针尖至样品的距离是指数关系,它对针尖至样品的距离改变极其灵敏(通常距离变化01nm,电流改变一个数量级)。这使得STM同时具有表面结构的实空间显示特性和原子尺度的高分辨本领。目前横向分辨本领可达01~02nm,深度分辨本领达001nm,放大倍数可达数千万倍。并且能直接给出三维图像。  STM由于成像原理不同于透射电镜,因而也突破了样品必须处于真空中的限制。它既可在真空中工作,也可在大气中甚至在液体环境中工作,这个特点特别有利于生物材料的研究,能够克服生物样品在真空中因脱水而产生的形变。此外,在STM中没有高能电子束对样品的作用,对样品表面没有破坏作用,从而避免了透射电镜中高能电子对样品的辐射和热损伤。生物样品,特别是生物大分子,极易受高能电子辐射的损伤,这种辐射损伤已成为透射电镜研究生物大分子结构的头等问题。STM由于不需要任何光学透镜和电子透镜,体积小巧玲珑,而又具有强大功能,所以获得了口袋显微镜的美称。  1983年以来,已经报道的用STM研究的生物Φ29噬菌体、生物膜、细菌细胞壁和DNA等。  DNA是生命遗传信息的载体,研究其形态结构对分子生物学具有重大意义。同时,DNA具有结构上的均一性与恒定性,在形态上易于识别,这在一定程度上避免了STM观察视野小(一般最大是几微米)的内禀不足。尽管DNA的导电机制还不十分清楚,国外还是有一些实验室用STM对DNA做了研究,并得到了令人振奋的结果。 
  7.共焦显微术共焦显微术(confocalmicroscopy)所用的仪器通常称为共焦激光扫描显微镜,即应用共焦的原理,以激光为光源,用扫描的方式进行工作。八十年代以后,由于有了高强度照明的激光光源、高速扫描技术和高效率的计算机图像处理系统才使共焦显微术进入了实用阶段。  共焦显微术的基本原理是对样品的照明光源只聚焦于焦平面的一点,检测器也只检测来自这同一点的光(称为共焦);扫描技术是将光点在样品的各点逐点扫描或按同样方式在整个样品的不同深度,逐层、逐点扫描;检测器将扫描信号输送到计算机图像处理系统,便可重建整个样品的清晰图像。用这种方法记录的图像数据系统与现代医学诊断用计算机断层(computerizedtomography,CT)所得的数据系统极为相似,也可看做是细胞的CT。  共焦显微术是非浸入性的无损断层扫描图像,因此能在活细胞上进行。图像处理可使样品的像进行三维重构,重现立体图像,还可从空间的任何角度观察其整个结构,并能将多片图像叠合而获得一个延伸焦点的图像。

 

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