免疫电镜技术是把免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来，使之兼有两方面的特性，所以是研究抗原抗体相互作用的一种方法。抗原抗体之间的相互作用是免疫化学反应的基础，它具有高度的特异性，结合电镜的高分辨能力和放大本领，可在超微结构和分子水平上研究各种组织和细胞内的免疫反应，并能精确定性、定位和半定量，使形态与机能紧密结合。　　目前免疫电镜主要分为有标记物和无标记物两大类。无标记物类的常用方法为抗原抗体直接作用后形成的免疫复合物的电镜观察。有标记物类，首先由Singer在1959年建立铁蛋白(ferritin)标记抗体技术；由Nakane和Pierce在1968年建立酶标记抗体技术；由Faulk和Taylor在1971年建立胶体金标记技术。此外，还有杂交抗体技术(Hybridantibodymethod)和铁蛋白抗铁蛋白复合物技术(铁蛋白抗体法)及凝集素(Lectin)电镜标记技术等。　　 1.抗原抗体免疫复合物(液相免疫电镜法)　　这种方法是用电镜直接观察抗原与抗体特异结合后形成的大分子复合物，具有简单易行、抗原和抗体用量少、在短时间内即可得出结果等优点。可用于检出病毒或进行病毒分型，并已用于临床诊断。具体方法甚多，只介绍常用的几种。　　(1)离心法：①取含病毒的待检样品02ml、生理盐水07ml和稀释的已知抗血清01ml，充分混合。一般情况下可使用不作任何处理的抗血清。如将抗血清进行40000r/min1小时离心和56℃30分钟灭活等处理，或使用纯化的抗体球蛋白，更可获得良好的电镜图像。对于一定量的抗原，所用抗体的浓度与形成的复合物有很大关系。抗体浓度太低或太高时，都不易形成大的抗原抗体复合物，所以要有适合的抗原、抗体比例。抗血清的稀释可用倍倍稀释法，也可用连续的10倍稀释法。②置37℃感作1小时，然后4℃过夜。　　③10000～15000r/min离心30分钟。　　④去上清，将沉淀悬浮在少量缓冲液或馏水中，涂片，负染色后立即镜检。也可37℃感作后立即涂片，镜检。　　(2)琼脂滤过法：①和②与(1)相同，③制琼脂板：吸取融化的08％琼脂约15ml铺在载玻片上，冷却后备用。这种琼脂板可冰箱保存数月。取一滴37℃感作后的抗原抗体复合物滴在琼脂板上。随即在复合物液滴表面放置覆膜的载网，使膜面向下漂浮在液滴上面。④经一定时间后，液滴的液相渐渐扩散进入琼脂层内，液滴逐渐扁平，载网下降，当复合物液滴中液相基本扩散完时，即可摄取载网负染。　　(3)琼脂聚乙二醇法：这一方法是琼脂过滤法的改良法，在琼脂板下面加聚乙二醇吸水。具体步骤如下：①配制聚乙二醇溶液，取30g聚乙二醇(PEG4000)溶解在100ml水中，振荡，使其完全溶解。②把滤纸折叠成约2mm厚半个载玻片大小，浸泡在聚乙二醇溶液中数分钟，充分浸湿后取出烤干，放干燥器内备用。③制琼脂板。取1g琼脂糖放于100mlpH72的巴比妥缓冲液中加热溶解，用吸管吸取约15ml琼脂溶液均匀地铺在干净载玻片上，凝固后置湿盒中，冰箱保存待用。④用刀片切取适当大小的琼脂板放在聚乙二醇纸片上，取一滴37℃感作后的抗原抗体复合物滴在琼脂板上，立即用覆膜的载网面向下浮在液滴上，当液相刚被吸收完时，立即摄取载网负染。　　 2.免疫标记电镜　　免疫标记电镜技术是应用在电镜下可见的标记物标记抗体(或抗原)，使标记抗体(或抗原)具有原标记物和抗体(或抗原)的特性，然后用标记抗体(或抗原)与相应的组织或培养细胞内特异抗原(或抗体)作用，形成不溶性免疫复合物，即在电镜下可见的标记物，以间接证实免疫反应的发生。理想的标记物应具备下述四个条件：①标记物与抗体应等价(摩尔比1∶1)，而且稳定地相结合，结合物应具有标记物和抗体蛋白的双重特征，结合物不与特异抗原之外的其它物质形成非特异性结合。②标记物要尽可能小些。较大的标记物与抗体蛋白结合后，将使抗体蛋白的立体构造发生较大的改变，从而降低与抗原的结合力。同时，较大的结合物难于通过细胞的膜结构，不利于检出细胞内的抗原。③在电镜下，标记物最好呈细微颗粒状，并具有足够的电子散射力，使成像有足够的反差。④抗原抗体标记物或抗原抗体抗抗体标记物反应后，其结合物在制片和观察过程中不应移位或变性。　　完全满足上述条件的理想标记物至今尚未发现。目前常用的标记物有：铁蛋白、辣根过氧化物酶、胶体金等。　　(1)免疫铁蛋白标记：　　马脾铁蛋白为直径11～12nm的球形颗粒，分子量650～900kDa，由蛋白质外壳和铁胶粒核心组成，核心直径5～75nm。铁胶粒含2000～3000个铁原子，集中分布为四个小点，电镜下为排列成菱形或方形的电子致密区，容易辨认。铁蛋白标记多用于病毒或细胞表面抗原的定位。　　①铁蛋白的提取和纯化：　　a.新鲜脾去除结缔组织后剪碎加馏水(1500ml/Kg组织)，置组织捣碎器内制成匀浆。　　b.将匀浆置水浴中加热至78～80℃，使铁蛋白以外的蛋白质变性，然后用每平方厘米16目和100目的不锈钢网过滤或用四层纱布绞挤过滤。取滤液，7000r/min离心15分钟。收获棕红色上清液，加固体硫酸铵(35g/100ml)，充分搅拌后置4℃过夜。　　c.3000r/min离心30分钟，弃上清，用馏水洗下沉淀，装入透析袋，4℃馏水透析，除去盐类。　　d.加2％硫酸铵，待溶后以4～5％的量加入固体硫酸镉，置4℃过夜。此时出现大量铁蛋白结晶，离心后即可获得棕色的粗制铁蛋白结晶。　　e.将铁蛋白结晶溶于少量2％硫酸铵中(pH585～59)，使溶液的蛋白质浓度为1％，3000r/min离心15分钟。每100ml棕红色上清液加5g硫酸镉，使重新结晶，置4℃2～3天。3000r/min离心15分钟，取沉淀。如此重复5～6次，可得到高纯度的蛋白晶粒。　　f.将每100ml溶液得到的铁蛋白结晶溶于75ml2％硫酸铵(pH585～59)，再加入等体积饱和硫酸铵，4℃过夜。3000r/min离心10分钟，取沉淀。重复3次以上，除去镉盐。最后将硫酸铵沉淀物放4℃保存。　　g.使用前，将沉淀物溶于少量馏水中，4℃对水透析，去掉硫酸铵后，再以01mol/LpH72磷酸缓冲盐水透析6～8小时。　　②铁蛋白的鉴定：　　a.光学显微镜观察：取少量铁蛋白结晶体置载玻片上并加盖玻片镜检。铁蛋白晶粒为金黄色或棕黄色的四面体或八面体。　　b.电镜观察：将浓度为500μg/ml的铁蛋白水溶液直接涂在覆膜载网上镜检或负染后镜检，可看到典型的单个铁蛋白分子。　　c.聚丙烯酰胺凝胶电泳：75％聚丙烯酰胺凝胶电泳出现三条带。　　③铁蛋白与免疫球蛋白的结合：　　铁蛋白与免疫球蛋白的结合，可用具有双功能的异氰酸盐类化合物如二异氰酸间二甲苯(mxylylenediisocyanate,简称XC)、2,4二异氰酸甲苯(toluen2,4diisocyanate,简称TC)作为偶联剂。使用这种偶联剂形成的结合物往往显著降低抗体活力，这可能与偶联剂的性质及某些作用条件有关。近年来多采用戊二醛作偶联剂，相比之下，对结合物的抗体活力影响较小，标记抗体的产量也高。用戊二醛作偶联剂有一步法和二步法。　一步法：将硫酸铵沉淀的铁蛋白对水和pH7201mol/LPBS透析后，按Lowry法测定蛋白质含量，使其浓度在25％左右。γ球蛋白的浓度为45％左右。按蛋白质绝对量取铁蛋白2份，γ球蛋白1份，混匀，然后加入1～2％戊二醛1/20份(戊二醛的最终浓度可为0005～005％)，搅匀后放37℃1小时，并不断搅拌，再置4℃1小时。　　两步法：在每亳升pH7001mol/LPB含50～80mg铁蛋白的溶液中，加入稀释的戊二醛，使其最终浓度为005～015％，总体积1ml，置37℃作用2小时。结合物经葡聚糖G25过柱，除去未结合的戊二醛。然后加入γ球蛋白，使铁蛋白的最终浓度为15mg/ml，球蛋白的最终浓度为3mg/ml。将混合液置37℃感作12小时(无需搅拌)，加入001mol/L赖氨酸中止反应。　　反应后的产物有四种成分，即铁蛋白标记抗体、未标记的γ球蛋白、未标记的铁蛋白和剩余的戊二醛。后者可通过对缓冲液透析或通过凝胶柱(葡聚糖G25或G50)除去。未标记的抗体球蛋白会竞争性地占据标记抗体与抗原作用的位置，未结合的铁蛋白会引起非特异性反应，必须尽量除去。纯化方法有盐析沉淀法和超速离心法。盐析沉淀法是在结合液中缓缓加入1/3体积的饱和硫酸铵，使成25％的饱和度。此时，棕黄色的铁蛋白标记抗体沉淀，未标记的抗体和游离的铁蛋白仍留在上清中，4000r/min离心15分钟，取沉淀物溶于少量01mol/L磷酸盐缓冲液中，通过葡聚糖G25柱以除去硫酸铵，流速1ml/4分钟，收集含有棕黄色的铁蛋白标记抗体，对聚乙二醇透析浓缩。使用前测定蛋白质含量，浓度范围为10～18％。　　超速离心法是将结合物经100000g1小时离心3次，铁蛋白标记抗体和游离铁蛋白沉下，而未结合的抗体球蛋白则浮在上清中弃去。将沉淀悬浮在缓冲液中，结合铁蛋白与游离铁蛋白用电泳分离，超速离心回收。　　可用琼脂双扩散法对标记抗体进行鉴定，用未标记的铁蛋白和球蛋白混合物(按结合时的比例混合在缓冲液中)作对照。标记抗体产生的沉淀线呈棕黄色，于生理盐水中浸泡数天不能漂去，以2％铁氰化钾酸性溶液染色，沉淀线变为普鲁士蓝色。混合物对照也出现沉淀线，沉淀线也呈棕黄色，但经生理盐水漂洗后棕黄色消失。　　④电镜样品制备：　　电镜样品制备有直接法和间接法两种。直接法简便易行，但敏感度低；间接法，制备一种标记抗抗体可用于多种试验，敏感度亦高，故一般多采用间接法。　　直接法是将培养细胞或组织经缓冲液漂洗后与特异性铁蛋白标记抗体作用，37℃1小时，用缓冲液充分漂洗，除去未结合的标记抗体。常规固定、脱水和包埋。　　间接法是先用特异性抗体与被检样品结合，37℃感作1小时后离心去上清，以PBS洗数次后再与标记抗抗体37℃作用1小时，以PBS漂洗数次，除去未结合的标记抗抗体。以后过程与直接法相同。　　在进行细胞内抗原定位时，可采取下述措施打开细胞膜，增加细胞对标记物的通透性，然后再进行免疫结合试验。　　a.冻融法。小块组织或细胞经5％福尔马林或1％戊二醛短时间(约5分钟)固定后冻融一次，使细胞膜破裂。　　b.冷冻切片法。小块组织短时间固定后,快速冷冻,切成10～15μm左右厚度的薄片。　　c.样品经戊二醛短时间固定后，以4×10-5mol/L洋地黄皂苷处理1分钟。　　为排除非特异性，必须进行对照实验。一般设下面几种对照：(a)正常组织或培养细胞对照；(b)样品先用未标记的特异抗体处理，然后再用标记抗体处理；(c)标记抗体先与特异抗原作用，再与样品作用；(d)用非特异性标记抗体处理样品等。上述4组对照都应呈现阴性结果。　　(2)免疫酶标记:　　免疫酶标记技术(immunoenzymatictechnique)是以酶为抗原抗体反应的标记物，它必须不改变抗原、抗体的免疫反应特异性，也不降低酶活性，而且与相应底物作用后形成不溶性的反应物。其结果是：光镜下为有色的可观察性终末产物，电镜下为电子散射力强的终末产物(图12-15)。用于免疫电镜标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AKP或ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、葡萄糖氧化酶(GOP)等。目前最常用的是HRP。　　免疫电镜技术对HRP的纯度要求高，一般使用Rz30以上者为好，而商品酶往往低于此值，在实验前要对Rz低于30的酶进行纯化。　　酶标记抗体的制备方法甚多，免疫电镜技术多采用戊二醛二步法。有关电镜样品制备的间接法介绍如下：　　①取材 如为单层细胞培养物，可先倾去培养液，用缓冲液洗1次后刮下贴壁细胞，离心成细胞小块。如为组织，则需快速冷冻切片(切成约10～15μm厚的切片)，融化后置离心管内离心成细胞小块。离心后倾去上清，加适量过碘酸赖氨酸多聚甲醛(PLP)固定液或者戊二醛多聚甲醛固定液固定。单层细胞于4℃固定05～1小时，组织则于4℃固定2～4小时。　　②抗体球蛋白感作 倾去固定液，用PBS洗3次，每次10分钟，洗去剩余的固定液。然后加入适当稀释的抗体球蛋白，37℃或室温感作2～4小时。感作后用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟，洗去未结合的抗体球蛋白。用25％戊二醛固定15～30分钟后倾去固定液，用PBS洗3次，每次10分钟，去掉剩余的戊二醛。　　③标记抗体(抗抗体)感作 加入酶标抗抗体，37℃或室温感作2～4小时，用磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟，洗去未结合的酶标抗体。用25％戊二醛固定15～30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟，洗去剩余的戊二醛。　　④显色 用005mol/L，pH76TrisHCl缓冲液洗5分钟，倾去缓冲液。加入显色液(取75mg3,3二氨基联苯胺溶于100ml005mol/L，pH76TrisHCl缓冲液内，临用前取所需量，于每ml中加1μl30％H2O2，使H2O2的最终浓度为003％)。室温避光显色15～30分钟后，再以TrisHCl缓冲液洗数次。加入适量1％锇酸固定液室温固定1小时，馏水洗去剩余的固定液。　　⑤常规脱水、包埋、切片 不染色直接镜检。 [HT5”SS]图12-15 牛白血病病毒感染羊胎肺细胞的辣根过氧化物酶标记的免疫电镜图像　　 　箭头所指的是被辣根过氧化物酶标记的病毒粒子，比例尺为200nm　　　               ——自李成等[HT5SS]　　(3)免疫胶体金标记:　　免疫胶体金标记技术又称免疫金染色技术(immunogoldstainingtechnique)，是利用胶体金(colloidalgold)在碱性环境中带负电荷的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记，制成免疫胶体金以研究抗原-抗体的关系，这是近年来发展起来的一项新技术(图12-16)。 [HT5”SS]图12-16 牛白血病病毒感染羊胎肺细胞的免疫金标记的电镜图像　　　　　　　　　 箭头所指是被胶体金标记的病毒粒子，比例尺为100nm　　　           ——自李成等 　　氯化金(又名氯金酸，HAuCl4)水溶液在还原剂作用下形成的金颗粒，在颗粒之间因静电作用而互相排斥，保持一个较稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金具有高电子密度和其表面能结合生物大分子的特性。Faulk和Taylor于70年代初首先应用胶体金作为透射电镜探针研究了沙门氏菌细胞壁表面抗原的分布。近年来，该技术几经改进，现已广泛应用于免疫组织化学和细胞化学等方面。该技术把免疫学中抗原抗体反应的高度特异性、敏感性与组织化学中形态的可见性有机地结合起来，可以在组织、细胞、亚细胞及分子水平上研究免疫作用。在透射电镜领域内，该技术已成功地应用于标记病毒、细菌、红细胞、骨髓细胞、淋巴细胞、血小板、肾细胞、肝细胞、神经元、垂体组织、十二指肠等的抗原和大分子方面的研究。目前应用胶体金单克隆抗体技术研究病毒结构，更精确地将结构与功能有机地结合起来。该技术是当前在生物学研究中比较理想的标记技术，介绍如下。　①免疫胶体金标记技术的优点　　a.胶体金是一种粒性标记物，具有较精确的定位能力，对超微结构的分辨影响较小，最小的粒子能在高分辨电镜下观察。此点优于酶标，因酶标产生弥散、形态不整的产物，往往会影响被标记物结构的观察；　　b.胶体金具有比铁蛋白更高的电子密度，它不易与动物机体内存在的铁蛋白及其产物相混淆；　　c.胶体金比其他标记物制备简易，只要有精确的试剂浓度、pH值和离子强度，就容易生产出好的产品；　　d.包被后胶体金颗粒的非特异性吸附比其他标记物低；　　e.胶体金颗粒具有较高的电子密度，因此具有较好的发射二次电子的能力，此点可用于扫描电镜观察；　　f.胶体金具有颜色反应，可用于光学显微镜观察；　　g.采用不同还原剂以及通过剂量的控制可制成不同粒径(3～150nm)的胶体金颗粒。小颗粒可在高分辨率的水平上进行观察，同时由于其颗粒空间位阻小，能更多的结合特异部位而提高敏感性；应用大颗粒胶体金标记，可在较低分辨率的水平上进行透射、扫描电镜观察；应用不同大小的胶体金颗粒同时标记一个样品，可用于多标记研究。②免疫胶体金标记技术程序　　a.胶体金的制备　　枸椽酸三钠还原法 取001％HAuCl4水溶液100ml加热至沸腾，迅速加入1％枸椽酸三钠水溶液4ml，约5分钟后出现橙红色，所制备的胶体金粒径约15nm，如将枸椽酸钠的量分别减至15、10或075ml，则胶体金的粒径分别增至约30、50或60nm。　　抗坏血酸还原法 将预冷至4℃的1％HAuCl4水溶液1ml、02mol/LK2CO3水溶液15ml、双蒸水25ml混匀后，在磁力搅拌下加入07％抗坏血酸水溶液1ml，混合后立即呈紫红色，随后加入双蒸水至100ml，加热至溶液呈红色。此法制备的胶体金粒径为8～13nm。　　白磷还原法 将双蒸水120ml、1％HAuCl4水溶液15ml与01mol/LK2CO3水溶液27ml混合，在缓慢搅拌中快速加入白磷乙醚溶液(附1)1ml，在室温中慢速搅拌15分钟，然后置100℃水浴30分种，贮存备用。此法所制备的胶体金粒径为5～12nm。鞣酸枸椽酸钠还原法 将1％HAuCl4水溶液1ml加入双蒸水79ml中混匀为A液；另将1％枸椽酸钠4ml、1％鞣酸07ml及01mol/LK2CO3水溶液02ml混合，加双蒸水至20ml为B液。二者同时加热至60℃，在磁力搅拌下将B液迅速加入A液中，继续加热搅拌至溶液呈亮红色。此法所得胶体金粒径为5nm。如将1％鞣酸用量变为001～4ml时，则粒径可从15nm减至33nm。若需制备5nm左右的胶体金，最好应用鞣酸枸椽酸钠还原法，此法所制备的金颗粒较均匀，而应用白磷法毒性较大，一般情况不用。b.胶体金抗体的制备(胶体金包被)胶体金对第二抗体(IgG)或葡萄球菌蛋白A(SPA)的吸附取决于其pH值，在接近蛋白质等电点或略偏碱的条件下，二者容易形成牢固的复合物，如果胶体金的pH值低于蛋白质等电点，则会聚集而失去结合能力。胶体金的pH值可用01mol/LK2CO3或01NHCl液调至待结合蛋白质的等电点或略偏碱(IgG的pH为90，单克隆抗体的pH为82，亲和层析抗体的pH为76、SPA的pH为59～62)为宜。　　首先找出胶体金和第二抗体(IgG)或SPA最适结合比例，即用第二抗体或SPA(含量为1～2mg/ml)50μl，以0005mol/LNaCl倍比稀释，分别于每一管中加入胶体金250μl，５分钟后，各管再加10％NaCl液250μl，即可观察到颜色改变。以没有颜色改变的最高稀释度作为胶体金和第二抗体或SPA结合的最适比例浓度。应用时再多加10～20％的抗体，以稳定蛋白质的实际用量。　　制备胶体金抗体时，按上述比例和要求，分别取所需量的胶体金及相应量的第二抗体或SPA，在磁力搅拌下将胶体金溶液加入第二抗体或SPA液中，10分钟后加入3％聚乙二醇(分子量为20000)至最终浓度为005％,以进一步稳定包被后的胶体金。　　c.胶体金抗体的纯化　　为了除去其中未结合的第二抗体或SPA及未充分稳定的胶体金和各种可能形成的聚合物，常用超离心法、凝胶过滤法纯化，但最常用的是超离心法。该法是在装好液胶的离心管底层加5％甘油005％聚乙二醇002％叠氮钠溶液2ml作垫层，经120000g离心1小时，液胶最后浓缩在其管底部呈暗红色(紧贴管壁的圆形液胶块不要收集，收集时应避免上清液混入液胶中)。收集的液胶可以浓缩或稀释成原体积的10倍，4℃保存。　d.应用胶体金抗体进行细胞抗原标记方法　　包埋前的标记法 以选用粒径约5nm的胶体金为例。首先将被病毒感染的组织或培养细胞用1％多聚甲醛002％皂素0025％戊二醛液固定1小时(4℃)，然后用05mol/LTBS(pH74)溶液(附2)洗30分钟，加适当稀释的相应高免血清(第一抗体)于室温作用30分钟后，4℃过夜，以002mol/LTBS(pH82)溶液(附3)洗2～3小时，加适当稀释的胶体金抗体，于室温作用30分钟，4℃过夜(最好在轻微搅拌下)，用002mol/LTBS洗5次以上，持续数小时(伴有轻微振动)。以后各步骤(戊二醛、锇酸固定、脱水、包埋、切片、铀铅双染色及电镜观察)按常规进行。　　超薄切片后标记法 该法通常是在冷冻切片、低温包埋切片或常规包埋切片后进行。后标记的优点是可以标记细胞中任何部位的抗原成分，对细胞的超微结构和功能生物大分子的发生、分布和相互作用的研究都很有意义。　　e.常规包埋切片的免疫染色法步骤　　超薄切片80nm左右(也可5～70nm)，置于无支持膜的300～400目镍网(或铜网)上；　　置1～10％H2O2液中处理10分钟～1小时，视环氧树脂硬度和切片厚度而定，(环氧树脂越硬，需H2O2浓度越高)，以除去锇酸和增进树脂的穿透性，利于抗体进入；双蒸水洗3次，每次5～10分钟；浮于正常羊血清(1∶50～1∶100)滴上，室温30～60分钟；PBS(内含1％牛血清白蛋白,pH82)中漂洗5分钟；加适当稀释的胶体金标记抗体液(1∶30～1∶100)，淡红色为适宜稀释度，置4℃20小时或室温10～120分钟；双蒸水洗3次，每次3分钟；醋酸铀和枸椽酸铅电子染色，待干后电镜观察。　　f.LowicrylK4M低温包埋切片的染色步骤　　1％BSA室温孵育30分钟；第一抗体作用，于4℃过夜或室温2小时；水洗，用PBS洗3次，每次10分钟；蛋白A胶体金(PAG)在室温作用1小时；水洗，用PBS洗1次，双蒸馏水洗1次；电子染色，用醋酸铀和枸椽酸铅液按常规法染色。g.胶体金抗体对病毒悬浮样品的标记方法　吸取病毒悬浮液10μl，滴在蜡盘上，将载膜的铜网膜向下放在悬滴上，经10～15分钟吸附，多余的液体用滤纸吸干；吸取适当稀释的相应抗血清(第一抗体)10μl滴在蜡盘上，将载样品的铜网放在液滴上，感作约2分钟；用015mol/L磷酸盐缓冲液(pH72)冲洗5次；吸取胶体金第二抗体10μl滴在蜡盘上，将上述冲洗后的铜网放在胶体金液滴上，经3～15分钟感作；用上述磷酸盐缓冲液冲洗6次，双蒸水冲洗2次，用滤纸吸干；用2％磷钨酸(pH65)负染色约30秒钟，用滤纸吸干，电镜观察。h.操作中几个需要讨论的问题　包被后的胶体金凝集现象，是该滤液中含盐成分过多之故。一般情况下，蛋白质大分子应当在无盐或极低盐浓度的环境中。另一方面，液胶的pH值对凝集也有很大关系，应调整到蛋白质等电点或略偏碱一点的范围，每一步骤的冲洗液也应符合所冲洗物的pH值。非特异性反应问题，应注意以下几点：第一抗体及胶体金抗体应稀释到最佳稀释倍数；抗体成分要纯；在操作步骤中冲洗要充分，尤其分别在第一抗体和胶体金抗体感作之后，一定要彻底冲洗，以除去未作用的反应物；由于包被后的胶体金溶液中含有未结合的多余蛋白质(第二抗体)，而这些蛋白质的分子量比包被后的胶体金抗体小，因此，在与第一抗体抗原复合物结合中，它抢先占据了抗原(第一抗体抗原复合物)结合的位置，使胶体金抗体相对地减少了结合的数量，所以在电镜下，在有些抗原位置上本应有胶体金存在，却看不到胶体金标记现象。关于胶体金穿透性问题，尽管在标记过程中为了增加细胞膜的通透性，加了皂素，但效果仍不理想。在细胞内的抗原位置和抗原集团内部仍很难发现胶体金标记现象。有人用冷冻断裂超薄切片法进行胶体金细胞内抗原定位，增加了细胞内部的通透性。　　附1：白磷溶液制备 在水中将白磷切成小块，用镊子快速投入约20ml乙醚中使达饱和状态，轻轻摇动至少2小时后，取上清液，以4800g离心20分钟，吸取上清液用乙醚稀释5倍，立即使用(注意，凡含有白磷的剩余物要用适量硫酸铜溶液破坏其毒性后方可倒掉)。　　附2：005mol/LTBS(pH74)溶液配制　　     Tris(三羟甲基胺基甲烷)  NaCl  蒸馏水121g175g1500ml[FL)]  在磁力搅拌下滴加浓HCl至pH74，再加蒸馏水至2000ml。　　附3：002mol/LTBS(pH82)溶液的配制　　     Tris  NaCl  牛血清白蛋白(BSA)  NaN3(叠氮钠)  蒸馏水484g175g20g10g1500ml   在磁力搅拌下用浓HCl滴至pH为82，再加蒸馏水至2000ml。

 

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