冷冻超薄切片技术是在光学显微冷冻切片和电镜超薄切片的基础上发展起来的。由于常规超薄切片技术中应用化学固定、有机溶剂脱水、树脂包埋等一系列处理，均可使生物样品受到物理和化学性损伤，引起组织和细胞内蛋白质分子变性，大部分可溶性成分及某些生物大分子物质被抽提或发生移位。为了弥补这些缺陷，人们创造了冷冻超薄切片技术。70年代后，出现商品冷冻超薄切片装置，使该技术有了更大发展。目前，此技术可在分子水平上研究新鲜生物样品的超微结构、各种生物大分子和某些元素在细胞内的分布状态，并在细胞化学、免疫电镜、X射线微区分析及可溶性物质放射自显影研究等方面发挥巨大作用。 冷冻超薄切片技术主要操作程序： 1.样品预处理冷冻超薄切片样品的预处理，包括两种方法:一种是样品直接冷冻固定，该法有利于保存生物样品中可溶性物质及生物大分子的活性、天然构型和保持元素的分布状态，主要用于生物样品内可溶性物质的放射自显影和X射线微区分析；另一种是对样品先采用戊二醛固定、冷冻保护剂浸泡等预处理，此法适用于细胞化学、免疫电镜等超微形态学研究。现将后一种方法介绍如下：(1)取材,为了保证制样效果，样品块越小越好，以小于1mm3为宜(直接冷冻法也相同)；(2)固定,用01mol/L二甲胂酸钠缓冲液(pH72)，将戊二醛配成25％的溶液，把取材后的样品块放入该溶液中固定15～60分钟。依实验材料和研究目的不同，固定液的浓度及固定时间可适当改变。如用1％戊二醛固定5分钟，可较好保存心肌线粒体嵴上球状蛋白质的构形；用02％戊二醛固定15分钟(4℃)，适于细胞内抗原的免疫铁蛋白标记的研究；(3)冷冻保护处理,当样品冷冻时，其细胞内液开始凝固时的温度，称为“冷冻点”，含水量80％的细胞约为-30℃。经逐渐冷却，水份就慢慢形成冰晶。如果冰晶太大就会使细胞变形移位，但到低于-80℃的超冷冻期时，就发展到“再结晶点”。超过此点以后，就不形成冰晶。冷冻的细胞内液成为均匀的玻璃状。冷冻保护剂的作用是为了提高细胞内液的浓度，降低冷冻点，从而减少冰晶形成。常用的冷冻保护剂有20～30％甘油、06～23mol/L蔗糖、20％二甲基亚砜(DMSO)、5％聚乙烯醇溶液等。处理时间从几分钟到几小时,一般认为甘油溶液是比较理想的防冻处理液，因为它具有润湿剂的作用，有利于负染色液的铺展与染色。 2.快速冷冻固定冷冻超薄切片质量的好坏直接决定于快速冷冻效果。常用的快速冷冻方式有二：一是液氮直接冷冻；二是金属接触冷冻。后一种方法较好，即将铜块先置于液氮中，待温度平衡后，将样品与铜块接触5～10秒钟，以达到快速传导降温的目的，然后再将样品置于液氮中待用。 3.切片 (1)冷冻超薄切片机：该机是在固有型超薄切片机基础上附加低温操作装置组成的。常用的机型是配以LKBCryoKit冷冻装置的瑞典LKBⅢ型(或Ⅴ型)超薄切片机。该装置包括：冷冻室、冷冻刀台、冷冻样品头、存放液氮的杜瓦瓶及温度和液氮水平控制器等。冷冻室是一个具有绝缘性能的塑料箱。它将冷冻刀台和冷冻样品头罩在其内。刀台、样品头分别有管道与杜瓦瓶相通，并通过管道不断向它们输送液氮；在刀台和样品头内有温度传感器及加热装置，有盛致冷剂的容器，容器内还有致冷剂水平感受器。当用液氮作致冷剂时，其样品头温度可控制在-70℃～-170℃，刀温控制在-70℃～-150℃。温度传感器是由温度及液氮水平控制装置进行自动调节,其调节过程是向刀台和样品台的致冷剂容器中灌满液氮。若将控制装置的温度选择在-100℃的位置，刀台和样品头的温度下降到-100℃以下，则传感器即给控制装置发出温度下降的信息，控制装置即可通过加热器产生补偿的加热电流，使刀台与样品头的温度保持在-100℃的状态。在切片过程中，由于液氮的不断消耗，致使容器中的致冷剂不断减少而液面下降，容器中的白金电阻器可感受液氮量的变化。当液面低于预定标准时，白金电阻器即可引起杜瓦瓶中的加热器工作以提高瓶中的压力，使瓶中的液氮向致冷剂容器中流动，直至容器中的液面又恢复到原来的水平为止。(2)切片操作：①向刀台和样品头的致冷剂容器中倒入液氮，使冷室的温度达到稳定的低温状态；②安装冷冻的样品头、玻璃刀(或钻石刀)，调整刀与样品的距离，调好温度及液氮水平控制装置；③自动切片，冷冻超薄切片的具体方法有以下两种：一是湿刀法，即用液槽法。切片槽里的液体需在低温下不冻结的液体，如二甲基亚砜、甘油、乙烯乙二醇、异戊烷等。当用二甲基亚砜时，其6％的水溶液在-60℃时可不结冻。切片时样品的温度常为-60℃～-80℃，刀温高于样品温度10～20℃为宜。其操作与常规超薄切片法相同，但宜放慢切片速度；二是干刀法，即不用液槽法，而用滴管上的饱和蔗糖液滴，粘起玻璃刀上的切片，然后将凝固的蔗糖液滴从冷冻室里移出，在室温下待蔗糖融化后，利用其表面张力使切片展平，并放在附有支持膜的载网上，用双蒸馏水洗去蔗糖后染色。但亦有人用注射器吸取30％甘油或二甲基亚砜液滴的方法，同样获得满意效果。 4.染色冷冻超薄切片可采用正染色或负染色。一般的形态学观察和超微结构研究，用负染色法为好。该法简单快速，有利于保存结构和分辨率高等优点。常用的负染色剂有磷钨酸(02～1％,pH65～85)、醋酸铀(05～3％,pH45～52)等，染色时间为5～60秒。如用正染色，应考虑到冷冻切片没有包埋介质支持，因此切片非常脆弱，须倍加小心操作。
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