冷冻蚀刻(Freezeetching)技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，故而亦称冷冻断裂(Freezefracture)或冷冻复型(Freezereplica)。它的优点在于：①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态；②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。它的缺点是：冷冻也可造成样品的人为损伤；断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。目前，冷冻蚀刻装置的型号很多，但主要分为两种类型：一种是专用冷冻蚀刻装置，如EIKO公司生产的FD2A型、FD3型，BALZERS公司生产的BAF300型；另一种是真空喷镀仪的冷冻蚀刻附件，如日立公司生产的HFZ1型，它与FE1型加温蚀刻装置一起安装在HUS5型真空喷镀仪中使用。以上两种类型各有优缺点，专用装置优点在于操作方便，能连续制样，效率高。缺点是价格贵；附件装置价格虽便宜，但不能连续操作，效率低。　　冷冻蚀刻的操作方法按以下步骤进行。　　 1.预处理取新鲜组织块，大小为15～3～5mm，用25％戊二醛固定1～3小时。为防止冰晶形成，用30％甘油生理盐水浸泡8～12小时。 2.冷冻断裂是在冷冻条件下使样品变得又硬又脆，用刀劈裂样品，暴露观察面。因为是用刀劈裂的样品，断裂往往发生在细胞被冻结后较脆弱的部位，多数是沿细胞及细胞器的膜裂开。由于断裂面是凸凹不平的，所以图像立体感强。冷冻断裂时，刀的作用在于劈裂，而不是切割，所以刀刃不必锋利，但不能有缺口、油污和水份，还需保持清洁干燥。冷冻复型的断裂操作要在真空中进行，是因为真空对热传导性差，能使样品较长时间维持在较恒定温度下进行断裂操作，同时也便于进行下步的蚀刻处理。仪器中进行断裂的最佳条件：真空度为133×10-5～3×40-3Pa(1×10-5～3×10-5Torr)，样品升温至-100℃～-110℃。　　 3.蚀刻就是在真空中使冷冻样品表面上的冰升华。目的是为了暴露出样品断裂面上的超微结构，便于喷镀。一般认为最佳蚀刻深度约为30nm。若蚀刻深度不够，结构被冰掩盖不能充分暴露出来，图像模糊；若蚀刻深度过大，超微结构因其基础支持不足而倒塌，从而破坏了超微结构。蚀刻深度是由蚀刻速度和蚀刻时间决定的，而蚀刻速度是受真空度、温度、水蒸汽压所影响。一般蚀刻条件：真空度为133×10-3～133×10-4Pa(10-5～10-6　Torr），温度降至-100℃，在此条件下，蚀刻速度大约为2nm/s。 4.喷镀即在样品断裂面上喷镀一层铂膜及碳膜。铂膜厚度为2～5nm。为使图像具有立体感，喷铂的方向与样品成45度角。为加固铂膜强度，再喷镀一层碳，喷碳的方向与样品面成90度角。 5.剥离清洗喷镀后，将样品取出放入10～30％次氯酸钠腐蚀液中，样品渐冒气泡并与复型膜分离。随后用蒸馏水仔细清洗复型膜。 6.捞膜将清洗后的复型膜捞在不加支持膜的400目载网上，待干后电镜观察。  　　　　　图12-14 马传染性贫血病毒感染驴白细胞的冷冻蚀刻图像。箭头所指为病毒粒子，比例尺为100nm    

 

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