超薄切片法是研究病毒特征以及病毒与细胞之间相互作用的有效手段。图12-5是生长在鸡胚羊膜细胞上的马甲2型流感病毒。可从图中清楚看到马甲2型流感病毒粒子的形态。病毒粒子沿细胞表面整齐排列，其远离细胞表面的一端比近端电子密度大。并可看到病毒粒子从细胞膜上芽生。 　图12-5 生长在鸡胚羊膜细胞上的马甲2型流感病毒 ——自贾补年等切片厚度很薄，需在01μm以下，用环氧树脂作包埋剂，一般可以制成5～70nm厚度的切片。超薄切片的制备包括固定、脱水、包埋、切片和染色。　 　1.固定　　固定的目的，是终止细胞的生化过程，保持细胞原来的微细构造，避免细胞自溶和造成人为假像。我们要研究的材料是各种各样的，材料本身的构造不同，各有特点，其固定条件也要随研究材料的不同而选择，不能千篇一律。一般说来，要求固定液能在固定期间维持一定的pH值；具有适当的渗透压，防止固定期间细胞或细胞器肿胀或收缩；具有适当的离子浓度，防止固定期间某些物质的沉淀或抽出。固定液本身应无毒性或毒性较小。为此，固定液要用缓冲液配制。　　(1)固定剂和缓冲液的性质：超薄切片用固定剂有戊二醛、四氧化锇、多聚甲醛、高锰酸钾等，常用的是前两种。　　商品戊二醛［CHO(CH2)3CHO)］是25％或239％的淡黄色水溶液，也有的是50％的水溶液。戊二醛应在4℃或-20℃低温避光贮存，长期室温贮存易形成聚合体。与细胞起反应的主要是戊二醛单体，单体的最大吸光度在280nm，聚合体的最大吸光度在350nm，故可用分光光度计测定戊二醛的纯度。Kurstak指出，OD２35/OD280比值大于3即显著降低其交联作用。不纯的戊二醛可用活性炭滤过或蒸馏纯化。活性炭纯化法是在市售25％的戊二醛中加入10％(W/V)的活性炭，4℃摇动1小时，然后滤过，可重复数次，直到吸收光谱达到标准为止。　　戊二醛的主要特点是：两个醛基可与细胞成分发生交联，对糖原和核蛋白，尤其是对微管和内质网等膜系统以及细胞基质有较好的固定作用；对组织的穿透力强，可固定数毫米的组织块；可保存某些酶的活性，对脂质不起固定作用。用戊二醛固定的组织，于4℃保存数周至数月不产生明显变化。　　商品四氧化锇(OsO4)呈淡黄色或无色结晶。溶点395～410℃，沸点130℃，溶于水、酒精、醚和氯仿等，在水内的溶解度是61g/100ml(18℃)，其水溶液不呈酸性。通常以玻璃安瓿包装，每个安瓿为05g或1g。　　四氧化锇的主要特点是能固定蛋白质。所以，虽然对核酸和碳水化合物的保存较差，但机体内核酸和碳水化合物都与蛋白质呈复合的形式，因而，四氧化锇几乎能和所有的细胞成分结合。四氧化锇与脂肪的不饱和脂肪酸链结合，形成脂肪锇复合物，对脂肪呈现良好的保存作用；但不能保存糖原，对微管的固定作用较差。四氧化锇分子大，扩散慢，对组织的穿透力较差，被固定的组织块不能大于1mm3。四氧化锇分子的密度大，具有电子染色作用。　　多聚甲醛是单功能试剂，不起交联作用。它的最大特点是穿透力强，因而可较好地固定大块组织。多聚甲醛可保存蛋白质、脂类和一些糖原，但不能保存多糖。多聚甲醛固定的组织呈可逆反应，因此漂洗时要注意。　　电子显微镜技术常用的缓冲液有磷酸缓冲液、二甲胂酸缓冲液和巴比妥醋酸缓冲液。　　磷酸缓冲液的配方甚多，效果相差不明显。这种缓冲液比其它几种缓冲液更符合“生理”条件，对细胞和操作者无毒性，因而使用很广。其缺点是在固定期间可能出现沉淀，污染样品。　　二甲胂酸缓冲液的优点是容易配制，溶液本身不利于微生物的生长，长期贮存稳定，加入低浓度(1～3mmol/L)的钙不发生沉淀。主要缺点是含胂，而胂是有毒物质。　　巴比妥醋酸缓冲液与上两种缓冲液比较起来，优点是不形成沉淀，缺点是缓冲力小。由于巴比妥钠能与醛起反应而失去缓冲力，所以这种缓冲液不能配制戊二醛固定液。　　(2)固定时间和温度的选择：要根据样品的性质、大小和固定液的成分决定固定的时间和温度。要选择适当的温度和时间，使得固定液和样品刚好起反应。时间过长，固定液将抽出样品中的某些成分，增加人工损伤，如戊二醛长时间固定会形成一种髓鞘样图形，四氧化锇长时间固定会抽出细胞质基质的许多蛋白质；固定时间过短，则固定不完全。　　一般来说，较致密的样品，固定时间要长些，疏松样品固定时间较短。样品块大，固定时间要长。有些样品在室温下固定效果好，有些样品则需要较低的温度，即0～4℃固定效果较好。温度低，样品的酶活性低，可减慢自溶，但固定液的渗透亦慢，为此，将延长固定时间。温度高，样品的酶活性高，自溶速度快，但固定液的渗透亦快，固定速度就快。在0～25℃间，看不出有显著差别，但最常用4℃固定。　　(3)固定方法：电镜工作者现已公认戊二醛和四氧化锇双固定的标准固定方法，即所谓的通用固定法，包括初固定、漂洗和二次固定等步骤。　　初固定(或前固定)：用25％戊二醛(01mol/L磷酸缓冲液，pH74，含有25mmol/L的氯化钙)或2％的多聚甲醛加25％戊二醛4℃固定1小时。　　漂洗：用磷酸缓冲液(01mol/L，pH74，含25mmol/L氯化钙)4℃洗1小时(其间更换3次以上漂洗液)。　　二次固定(或后固定)：1％四氧化锇(01mol/L磷酸缓冲液，pH74，含25mmol/L氯化钙)室温或4℃固定1小时。　　先用戊二醛再用四氧化锇的双固定法有许多优点，一是戊二醛和四氧化锇能保存的样品成分不尽相同，双固定法可以取长补短；二是样品在戊二醛固定液内或经戊二醛固定后，可贮存较长的时间；三是戊二醛渗透速度快，可固定较大的组织块，先用戊二醛固定样品，便于切成适合于四氧化锇固定的小块。　　戊二醛是还原剂，四氧化锇是氧化剂，所以用戊二醛作为初固定后必须彻底洗去未反应的戊二醛，才能用四氧化锇进行二次固定。　　在固定前或固定中要对样品进行适当的修整，否则将形成严重的人工损伤。一般要求：　　快：力争在半分钟内将样品浸入固定液。　　小：常用固定液穿透力较弱，样品块应小于1mm３。　　准：电镜的放大倍数大，因而观察的样品面积很小，所以，选择部位要准。　　利：要用非常锋利的器械，通常用刮脸刀片切割，避免因牵拉和挤压造成人工损伤。　　样品不同，固定过程亦不完全相同。在病毒学研究工作中，最常见者是组织培养的单层细胞和动物组织。　　①单层细胞的固定：　　单层细胞多用沉淀块法固定，即用橡皮刀或刮子刮下贴壁细胞，把细胞悬液倒入10ml尖底离心管内，1000～2000r/min离心10分钟。　　初固定：倒掉管内上清液，沿管壁慢慢加入0～4℃的2％戊二醛固定液，注意加时不要冲散沉淀块。加入的固定液量要为沉淀块体积的10倍以上。4℃下放15～30分钟。　　漂洗：取出沉淀块，放在蜡盘上，加数滴4℃缓冲液(如用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，则要配成005～01mol/L浓度，每100ml缓冲液加入73g蔗糖，调整缓冲液的渗透压)，用刮脸刀片把沉淀块切成约1mm3大的立方块，用镊子或吸管放入带盖小玻瓶内，4℃用缓冲液漂洗3次以上，每次数分钟，充分洗去未结合的戊二醛。　　二次固定：倒掉漂洗液，加入4℃的1％四氧化锇固定液，加入量约为样品块体积的10倍，4℃下放1～2小时。　　在某些研究工作中，要求将细胞原位固定后再刮下离心，或者用多聚甲醛、四氧化锇、高锰酸钾作为初固定。在这些情况下，沉淀块疏松，当进行下面各过程时容易丢失样品，为此，可把样品悬浮在液态琼脂中，凝固后切成小立方块再进行漂洗和二次固定等过程，具体方法如下：　　a.用缓冲液配制成2％的琼脂溶液，加热融化备用。　　b.把盛琼脂缓冲液和沉淀块的离心管都放在45～50℃水浴中加温。　　c.用一温热吸管吸一滴琼脂(约003ml)溶液加入沉淀块试管内，摇动，使细胞均匀悬浮在琼脂中，浸10分钟以上。　　d.用温热吸管把悬液吸出滴在冷载玻片上形成1小滴。　　e.凝固后把含细胞的琼脂凝块切成约1mm3的小块进行漂洗、二次固定等。　　要注意尽可能少加琼脂，否则，切片上的细胞数量将很少。　　也可全部都悬浮固定，即初次固定、漂洗、二次固定都用离心方法进行。二次固定后，再按上述方法包在琼脂中，而后进行脱水等。　　②动物组织的固定：根据不同的研究目的用不同的方法。一般是直接从活体或杀死的动物体切取适当的组织放入固定液浸泡固定。有时需将动物麻醉，解剖出要研究的器官或组织，将固定液直接滴在这些被研究的器官或组织上，也可直接注入器官或组织内部，这样可保证血液供给，避免因缺血造成的损伤。经这样固定后，切取适当的组织在室温或4℃继续浸泡固定1小时。固定液用5％戊二醛为宜。以下过程与单层细胞沉淀块法相同。有些研究者用灌注法固定，这种方法是用固定液逐步取代动物体内的血液来达到固定目的。其优点是固定效果好，缺点是需用固定液的量大，方法复杂，所以，除特殊需要外，不经常使用。　　 2.脱水　　目前使用的大多数包埋材料不溶于水，因而需要把固定后的样品脱水，才可使包埋材料浸入样品内部，达到包埋目的。使用最广的脱水剂是丙酮和乙醇。脱水剂需从低浓度到高浓度逐步过渡，否则将因组织急骤收缩而出现人工损伤。　　常规脱水方法：此法用于单层细胞培养物。　　　　  50％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分钟　　　　  70％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分钟  95％丙酮(或乙醇)水溶液，4℃，10～15分钟　　  100％丙酮(或乙醇)，4℃，10～15分钟　　  100％丙酮(或乙醇)，室温，10～15分钟　　　  100％丙酮(或乙醇)，室温，10～15分钟　　100％丙酮或乙醇要用干燥剂吸水，一般使用烤干的硫酸钠或硫酸铜。　　快速部分脱水方法(Robbins等，1967)：　　  20％乙醇80％水，室温，30秒　　　  60％乙醇40％Epon812，室温，5分钟　　　　  30％乙醇70％Epon812，室温，5分钟　　　  100％Epon812，室温，5分钟　　随后即可用Epon812浸透和包埋。　　环氧丙烷可快速与环氧树脂混合，并且即使在包埋剂中残留少许，聚合后也不会出现不良后果。所以，一些不易浸透的样品在脱水后经过两次环氧丙烷处理，每次15分钟，随后再浸透和包埋，这样可减少浸透不完全的缺陷。脱水后的样品要严防湿气。因此，使用的器皿应是烤干的，室内相对湿度以50％左右为宜。　　 3.包埋　　包埋的目的是用包埋剂支持整个样品结构，并形成特定的机械性能,以便于切片。　　(1)包埋剂的性质及种类：　　①理想包埋剂应具备的特性：单体时粘度低；聚合均一，体积变化小；容易切片；在电子束轰击下稳定；电子透明度好，不形成背景反差；易溶于脱水剂；不同批号的产品，性能一致；价格低廉，容易获得。　　②包埋剂种类：　　a.环氧树脂类 Epon812和Quetol812以及国产环氧树脂618是常用的包埋剂，尤其是Epon812更为常用，它是由甘油和表氯乙醇反应而来的7个单体组成，对电子束稳定，但由于含有较高的疏水成分，故粘性较大，且因含二环氧化物而有致癌性。618为二酚基丙烷型环氧树脂，是目前使用较多的国产环氧树脂，它对组织损伤小，保存结构精细，特别是对膜性结构保存更好，但粘度大，浸透不均匀，操作不太方便，若与国产600型环氧树脂混合使用，可降低其粘度。Araldites属芳香族类，对热及电子束有很好的稳定性，交联程度低，粘度小是其优点；Spurr(ERL4206)是一种乙烯环已烷二氧化物，由长链脂族酐交联，它在环氧树脂类里是粘度最低的，但缺点是毒性大并具有致癌性。Durcupon为脂族多聚环氧化物，粘度低，因它与非水溶性的其它环氧树脂和水溶性的异丁酸类树脂都具有亲和性，常用来做浸透剂，以代替环氧丙烷。　　b.丙烯类树脂 Lowicryl是一类重要的丙烯树脂，为极性丙烯酸和异丁酸酯，由脂族乙二醇二异丁烯酸交联，与Epon一样对电子束稳定，在低温下具有粘度低，脱水快和浸透好的特点，聚合时用苯偶姻甲酯作始动剂，在波长360nm紫外线间接照射下低温(-30℃～-50℃)聚合过夜。Lowicryls包括亲水性的K4M、K11M及疏水性的HM20、HM23。前二者的脱水剂可用甲醇、乙醇、丙酮、甘油等，因其在组织含有5％水分时也可聚合，所以浸透可在部分水化状态下进行，后二者的脱水剂不能用甘油和乙二醇，它可在-70℃下使用，许多生物物质可保持稳定，甚至可保存结合水。LRWhite与LRGold是亲水性丙烯酸单体混合物，交联稳定，粘度低，可迅速浸透组织，对电子束稳定，组织经70％酒精脱水即可进入LRWhite中浸透，聚合可在50℃或室温下进行，如果使用加速剂则可在10～20分钟内聚合。丙酮在该树脂内可作为一种自由基清除剂，只要有一点丙酮残留都会影响聚合，因此一般不用丙酮作脱水剂。在聚合时要注意尽量减少氧气的存在，用带盖胶囊聚合。GMA是由乙二醇甲基丙烯酸酯组成，含有3％水分，多用于细胞化学研究，不需去除树脂就可用很多特殊染料染色，组织先在含有70％蔗糖缓冲液中放置，然后用含水量渐少的GMA及纯GMA浸透包埋，于紫外线照射下4℃聚合。　　(2)包埋剂的配制：　　目前最常用的是环氧树脂类。环氧树脂是一种热塑性树脂，呈蜜黄色半液体状，有环氧基和羟基两种化学反应基团，当与一定的酸酐(如顺丁烯二酸酐、十二烷基琥珀酸酐和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐等)混合后，在一定温度下交联成稳定的网状大分子结构，其机械性能取决于单体和硬化剂(即酸酐)的比例，因此，选择适当的配比，才能保证切片质量，例如，当用Epon812时，一般选酸酐与树脂的比为07。　　①618包埋剂配方Ⅰ　[FL(]    环氧树脂618  顺丁烯二酸酐  苯二甲酸二丁酯(简称DBP)  二乙基苯胺5ml2g15～2ml04ml   　　将环氧树脂618倒入烧杯内，加热至80℃，用注射器或量筒量取所需量的环氧树脂618置广口玻瓶内，加入顺丁烯二酸酐，放入80℃温箱中约5～10分钟，使其溶解(因顺丁烯二酸酐的溶点为56℃左右，需加温溶解)，用磁搅拌器或玻棒搅拌5～10分钟，搅拌均匀后冷至室温，用注射器加入DBP，搅拌均匀后备用。用前半小时左右，用带针头的小注射器在搅拌情况下，逐滴加入二乙基苯胺，加完后继续搅拌5～10分钟即可使用。　　②618包埋剂配方Ⅱ     环氧树脂618　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  十二烷基琥珀酸酐(DDSA)　6ml4ml 　　　　　　　　    2,4,6三(二甲氨基甲基苯酚)(DMP30)01ml　　用注射器或量筒量取618和DDSA，充分搅拌均匀后逐滴加入DMP30，边搅边滴，加完后继续搅拌5～10分钟。溶液比较粘稠，可放37℃温箱使其变稀，气泡逸出。用前半小时配制。　　③618包埋剂配方Ⅲ　　考虑到618配方Ⅱ比较粘稠，聚合块较脆，加入DBP增塑剂后，易于切片。　　　　     环氧树脂618  DDSA  DBP  DMP30   6ml   4ml   03～08ml   03～02ml 　　  ④Epon812包埋剂配方     A液： Epon812 DDSA  B液：Epon812   62ml   10ml   10ml  甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐(MNA)  89ml    DMP30占总重量的15％　　先配制成A液和B液备用。使用前将A液与B液按一定比例混合后搅拌均匀，然后边搅拌边滴加DMP30，搅拌均匀。A液和B液的比例随气候而改变，通常冬天使用A∶B＝2∶8，夏天使用1∶9或纯B液。A液多，聚合块软；B液多，聚合块硬。通常根据环氧值计算的重量百分比，按表12-2的配方进行配制。　　　　　　　　　　　  表12-2 环氧树脂包埋剂的配制   包埋剂数量(g) 　MNA(g)　　 　DDSA(g)　 　　E(g)　　 DMP30(g) 　10　　　 　　　30　　 　　　15 　　　55　　 015 　20　　 　　　60　　 　　　30　　 　　110　　 030 30　　 　　　91　　 　　45　　 　　164　　 045 40　　 　　121　　 　　　60　　 　　219　　 060 　　　50　　 　　151　　 　　　75　 　274　　 075  　　(3)浸透：　　浸透是用包埋剂置换样品内的脱水剂或中间溶剂。这一步一定要彻底，否则得不到好的切片。如果用环氧丙烷作脱水剂与包埋剂的中间溶剂，虽残留少量环氧丙烷并不影响切片质量。　　一般情况下，可先用脱水剂和包埋剂1∶1混合液过渡，然后再用纯包埋剂置换。如果样品较致密，可用脱水剂和包埋剂2∶1、1∶1、1∶2混合液、纯包埋剂逐步置换，也可用环氧丙烷作为中间溶剂置换脱水剂，再用环氧丙烷与包埋剂1∶1混合液和纯包埋剂置换。把样品放在慢速振荡器上浸透，可收到很好效果。此外，减压也可促进浸透。　　(4)聚合：聚合就是将已浸透的样品固化。有两种聚合方法，一是加温，二是紫外线照射。加温是常用方法，大多数环氧树脂包埋剂于60℃12小时即可固化，50℃约需2天，70℃约需8小时。一般用35℃、45℃、60℃各12小时聚合，或60℃24～48小时聚合。某些组织化学样品，加温将破坏其中一些成分，如酶活性等，则可用紫外线照射聚合，50℃需48小时，40℃需70小时。　　(5)水溶性包埋剂包埋方法：样品经固定水洗后不必经过脱水，可直接进入各级Durcupan中，最后入Araldite包埋。

其具体步骤如下：　　　　  50％ Durcupan水溶液　     20分钟 　

↓                        70％ Durcupan水溶液　　　     20分钟