实验室内培养的细胞株,需要定期传代,这是一项繁重的工作。而且,由于传代次数增多,相应地增加了细胞污染和变异(包括恶性变)的危险性。二倍体细胞的建立,更要求减少传代次数,以免发生过早的衰老死亡。因此,细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作。这一问题现已基本获得解决,特别是细胞低温保存方法的成功,极大地保证和促进了细胞培养工作的发展。

1.细胞培养物的常温短期保存〖HT〗细胞株和传代细胞系的短期保存并不困难。将已长成单层的细胞于换液后置室温或20～22℃温度下避光保存,一般均可保持细胞的生活力达半个月以上(某些细胞,如BHK〖DK〗21细胞,最多能保存7天左右)。但维持液中的血清含量应提高至5%～10％。与动物组织块的保存方法不同,细胞培养物不宜在4℃保存。单层细胞在这种温度下易于发生退化现象,并且较快由培养瓶壁脱落;继续传代培养时,细胞活力也明显降低。如果传代培养时将培养温度由37℃降至32℃甚至30℃,则细胞生长缓慢,老化也迟,可以每隔15～30天传代一次。作者等试用30～32℃的温度培养HeLa细胞、人羊膜传代细胞、猪肾细胞(PK〖DK〗15和IBRS〖DK〗2)和驴胎继代细胞等,20～30天传代一次,细胞的形态和活力未见明显变化。如果细胞在这种温度下生长太慢,不能长成单层,可先将其置37℃培养,待其生长增殖而将形成单层时,再行移置于30～32℃培养。但必须指出,由于缺乏详尽的细胞学和病毒学上的鉴定数据,上述的细胞保存方法只是一种可被偶然采用的权宜之计,不能作为细胞保存的基准方法。在需长途运送细胞培养物,例如经火车或飞机送往远处时,可选择刚刚长成单层的细胞培养物,弃去营养液,加入维持液至满瓶,勿使培养瓶内存留空气。随后用橡皮塞紧塞瓶口,并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15～25℃左右。到达目的地后,将培养瓶内的维持液倒出,仅存留正常的维持液量,并置37℃温箱中培养1～2天,即可进行传代培养。如系炎热夏天,气温太高,而运输路途又远,则可取不漏水的塑料袋1个,放入若干冰块,扎紧袋口,并置入广口保温瓶内,同时放入已用纱布适当包扎的细胞培养瓶,使保温瓶内的温度保持在10～30℃之间。

2.细胞培养物的低温长期保存〖HT〗早在40年代,人们就已证明人类精子对-79℃乃至-196℃的低温具有一定的抵抗力。随后又发现,甘油对低温保存的动物细胞具有良好的保护作用:细胞悬液中加入甘油,可以明显地提高其在-79℃的活存率。60年代以来,另一种化学试剂——二甲基亚砜(DMSO)又被用作细胞低温保存的保护剂。应用甘油或DMSO已经成功地保存各种组织细胞,特别是在使用-196℃的液氮以来,已经可以几年或更长时间地保存细胞。实验证明,当细胞悬液的温度较快下降到0℃以下时,细胞内开始形成冰结晶,这种冰结晶是使细胞产生机械性损伤的主要原因。温度继续下降,细胞外相的冰结晶增多,残留液中的盐类浓度增高,水分从细胞内抽出,其结果,细胞内的可溶性物质特别是电解质在残余的少量水中逐渐浓缩,又使细胞发生渗透性休克。因此,细胞在被冷冻至0℃以下时,将先后或同时发生冰结晶形成、脱水和可溶性物质浓缩等三种变化。而在快速冰冻时,细胞膜又易发生损伤。但如果温度下降缓慢,例如每分钟下降1℃,则发生另外一种情况:细胞内并不出现冰结晶,冰结晶主要形成于细胞外,细胞本身只发生逐渐的脱水,并不遭受严重损伤。因此,“缓慢冰冻”是保护细胞,使之不致发生严重损伤的关键因素。由于细胞内冰结晶的形成和电解质的浓缩主要发生在-5℃和-10℃之间,因此只要严格控制0℃～-20℃范围内的温度下降速度,即可明显减轻细胞在低温冰冻过程中的损伤程度。甘油和DMSO是非电解性物质,具有较强的亲水性,而且易于穿透细胞膜,可以减轻冰结晶对细胞的机械性损伤作用;此外借助其弥散作用,又可置换细胞内的水分,避免因细胞内脱水而发生电解质浓缩,且使细胞不致发生绉缩。相反,已在低温冰冻保存的细胞,融解时却又必须十分迅速,否则也会产生严重的细胞损伤。因在缓慢融解时,当细胞由最低温度(例如-196℃)逐渐上升至-20℃～-5℃时细胞内也会形成冰结晶和发生电解质浓缩。因此,一般是将低温保存的细胞安瓿直接置入37℃～40℃的温水中,使其尽快融解,以减少细胞损伤。总结细胞低温保存的经验,可以归纳为一句话,那就是:“缓慢的冰冻和迅速的融解”。至于什么样的低温条件最有利于细胞保存?何种温度是其可以允许的上界?则还没有充分的研究。一般认为,保存温度最好低于-130℃,因在-130℃以下的低温下,细胞的生命活动降至最低点,有利于长期保存细胞。液氮是目前广泛应用的冰冻剂。(1)细胞悬液的制备:将已长成或即将长成单层的生长旺盛的细胞,例如培养2～3天又经换液1～2天的单层细胞,按该细胞的常规消化方法消化分散,并在该细胞常用的营养液内作成分散的细胞悬液,倾入离心瓶内,以500r/min离心沉淀5～10分钟,弃去上清液,于沉淀细胞内加入含10％DMSO或甘油的营养液(血清含量为10～15％),其量约为原营养液量的1／4。吹打混合并作必要的稀释,使成每ml含2～5×106个细胞的悬液。应该强调指出,在将DMSO溶液加于沉淀细胞中时,必须一滴滴地缓慢加入,同时将离心瓶置于冰浴内,以免DMSO溶液产生潜热,损伤乃至致死细胞。甘油和DMSO均应为分析纯试剂。甘油用高压灭菌,DMSO用滤器过滤除菌,两者均分装于小瓶,紧紧加塞后保存于普通冰箱内,不宜多次开启,以免形成有毒的氧化产物。(2)装瓿和封口:将上述细胞悬液分装于1ml的硬质玻璃安瓿内。在距细胞悬液面3cm处用酒精喷灯封口，以免烫死细胞。封口必须十分可靠，否则在由液氮中取出时可能发生危险的爆炸。因此，应将已经封口的安瓿置入05％甲基蓝溶液中10分钟。凡有蓝色液进入的安瓿应即废弃，并将合格的安瓿置自来水下冲净后擦干，准备冷冻。(3)冷冻：将细胞安瓿置于特制的预冻装置内，使其温度缓慢下降(每分钟1℃)直至-20℃。此后即可将其迅速置液氮中。如果没有特制的预冻装置，可将细胞安瓿放入一个适合的纸匣内，衬垫棉花加以固定，切勿倾斜。匣外包裹3层棉花，每层厚1cm，再用橡皮带扎紧,随即置4℃冰箱内6小时，取出后置入-20℃冰箱内24小时。在由-20℃冰箱内取出后，迅速除去棉花层，并从匣内取出安瓿，立即浸入液氮保存。液氮罐由低温合金钢制成，配有提壶。在灌入液氮后，即可将提壶直接浸入液氮内。为防止安瓿漂浮，可在安瓿上放一些玻璃珠压住。当液氮罐内的液氮蒸发过半时，即需加灌新的液氮。根据液氮罐的容量和使用情况，例如开启的频度等，一般每15～25天加灌一次新的液氮。由于液氮罐内不断逸出氮气，故应将其置于通风良好的房内。(4)复苏和培养：需取用细胞时，可用竹镊子取出细胞安瓿，迅速投入37～40℃的水浴锅内，加盖并适当摇晃，使冰冻的细胞迅速融解(40～60秒内)。随即取出已融化的细胞安瓿，用75％酒精消毒后，用安瓿锯锯开颈部，用几层灭菌纱布掰除安瓿顶部后，用毛细吸管吸出细胞悬液，置入培养瓶，并于每ml细胞悬液内加入10倍量预热至37℃的营养液。营养液中的血清含量提高至10%～15％。置37℃的CO2温箱内培养4～12小时。在细胞贴壁后，即可换入新的营养液，继续培养至长成单层后换液，并考虑传代。也可在细胞悬液内加入10倍量营养液后，即以500r/min的速度离心沉淀10分钟，倾弃上清层，彻底除去保护剂，再在沉淀细胞内加入营养液，充分混悬后分瓶培养。营养液的最后加入量以原培养的细胞营养液为准。例如由10ml细胞培养物制成的冷冻细胞，在融解和离心沉淀后可再悬浮在10ml营养液中进行培养。如果低温保存条件不理想，例如冷冻速度不够缓慢……等等，则因细胞死亡较多，最后的营养液量可减半。细胞计数时，每ml营养液中的活细胞不应低于20～30万。如果没有液氮设备，可将上述已经预冻处理的细胞安瓿置-70℃冰箱内。在液氮中保存1～2年的细胞，活存率一般可达80%～90％，而在-70℃冰箱内保存同样时间的细胞，活存率不到10％，有时只有3％左右。液氮操作必须十分小心,应穿戴防护服、面罩和手套，特别注意防护眼睛。没有封严或有裂纹的安瓿中可能渗入液氮，当由液氮中取出时，因液氮快速蒸发而发生剧烈爆炸。皮肤接触液氮也会引起严重冻伤。近来改用塑料安瓿，就比较安全了。