3.细胞培养〖HT〗自1949年Enders等报道脊髓灰质炎病毒在非神经细胞内培养成功并形成细胞病变以来,随着细胞污染和分散剂的进一步解决,已有数百种动物病毒在细胞培养上获得成功。现代组织培养技术已能使动物的绝大多种细胞在体外培养增殖,并培育出多株二倍体细胞株、可以长期传代的异倍体细胞系、融合细胞以及外源基因导入细胞等多种用途的细胞。细胞培养与实验动物和鸡胚相比,不仅经济、方便、省时、省力,而且能提供大量生物性状稳定的细胞群体,降低了外界因素的影响,使实验结果更加准确可靠。因此,细胞培养是病毒学实验研究必不可少的重要工具和手段。在临床病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系三大类,其中以原代细胞对病毒最敏感。从细胞的来源则可分为人源、各种动物源、禽源和昆虫源等。虽然各种病毒均对其来源动物的细胞最敏感,但也有很多细胞(如鸡胚成纤维细胞等)和传代细胞株、细胞系(如BHK细胞系等),对其来源动物种类以外的多种病毒也能感染。经过细胞培养传代的毒株,其细胞适应性(细胞感染范围)常更为广泛。从细胞培养方式的不同,可分为静止培养、转管(瓶)培养和悬浮培养等,其中以静止的单层细胞培养最为常用。悬浮培养及转瓶培养适于大规模培养细胞,是生产疫苗、干扰素、激素、单克隆抗体和基因工程多肽等生物制品的重要手段。此外还有着眼于扩大细胞培养面积的微载体培养法等。(1)单层细胞培养:现将细胞培养过程中,关于细胞密度、营养液pH、换液和培养温度等几个带共性的问题介绍如下。细胞密度:一般讲,密度大些的细胞生长快,但过大对细胞生长不利,而且细胞很快老化。原代肾细胞的密度以每ml营养液中含40～60万个为宜。鸡胚成纤维细胞约50万/ml。传代细胞系最少,约20～30万/ml。营养液pH:细胞生长最适的pH范围为70～74。细胞通常可耐受pH66～78较大范围的变化,但在偏酸、偏碱环境下的持续时间不宜超过24小时,否则细胞将很快老化和脱落。生长液pH较偏碱更适于细胞贴壁,但培养时的pH仍应保持在72～74之间。因为细胞代谢产生的酸性物质很快使pH下降,而影响细胞继续生长。维持液可稍碱些,调到pH74左右。使用CO2温箱能提供稳定的5%CO2,可以有效地自动调节细胞代谢引起的酸碱度变化。另外在培养液中加入氢离子缓冲剂(如HEPES)能增强培养液的缓冲能力。换液:原代细胞生长较慢,在培养48～72小时左右换液,能促进细胞增殖,尽快长成单层。以后则视实验需要和pH变化随时换液。传代细胞生长旺盛快速,在48～72小时长成单层后,应及时换液和使用。如果培养只是为了传代保存细胞,则应于换液后24～48小时,即细胞处于生命旺盛时进行下一次培养传代。换液,通常是将旧液全部换为新液,但细胞生长缓慢而且形态不正常时,可只换入一部分新液,保留1/4～1/2的旧液。培养温度:细胞的培养温度应与细胞来源动物的体温一致或略低1～2℃。细胞通常能耐受较低温度,但增殖缓慢,多数细胞在30～32℃时,仍可维持其基本代谢和形态。细胞对高温敏感,温度提高2～3℃即产生不良影响,首先发现形态改变,随后则发生脱落和死亡。盛夏季节炎热潮湿,更要注意无菌操作,防止细胞遭受细菌、尤其是霉菌污染。单层细胞培养是研究病毒生物学特性以及病毒与细胞相互作用过程的合适模型。应用单层细胞培养病毒,常可获得大量高效价的病毒液,用以制造特异性病毒抗原或病毒疫苗。同时,由于单层细胞培养法的设备条件和操作方法比较简单,因此,单层细胞培养已是当前病毒学中应用最广泛的一种细胞培养方法。下面重点介绍几种单层细胞的培养方法。①原代细胞培养:应用动物组织器官或胚胎,经过剪碎、消化分散成单个细胞后进行的培养,即为原代细胞培养。将长成单层的原代细胞培养物,再进行消化分散成单个细胞后继续培养,以及随后的连续传代培养,则称继代细胞培养。这种培养细胞可保持原来的二倍体形态,对病毒比较敏感,尤其是原代细胞培养。各种组织原代细胞的培养方法大体相同,举有代表性的胚胎和组织及白细胞培养方法说明如下。1)鸡胚原代细胞:在无菌条件下采取9～10日龄鸡胚,置灭菌平皿中,除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏,并剪成块,用Hanks液等充分冲洗后移入大号链霉素瓶或其他广口瓶中,用眼科弯形剪将其剪成1mm大小的碎块,加入Hanks液或其他洗液,充分冲洗,并静置几分钟,待组织块下沉,吸弃上层液体,再加洗液,如此反复冲洗2～３遍后,吸弃上清液。于沉淀组织块内加入约4倍量的025%胰酶,并调整pH至76～78振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟,每10分钟轻轻摇动一次。取出后小心吸弃上层胰酶溶液,用洗液轻洗2次后,即在洗液内以大口吸管吹打数次或十数次,此时即见大量细胞游离,液体变浑,经用双层亚麻布或72孔不锈钢纱网过滤,收集于离心瓶(管)中,以600r/min的速度离心沉淀5～10分钟,吸弃上清液,按每个鸡胚5ml的量,加入营养液,并用吸管充分吹打,直至形成均匀的细胞悬液,准备细胞计数。细胞计数时,取上述细胞悬液05ml,加入01%结晶紫-枸橼酸(01mol/L)溶液2ml,置室温或37℃温箱中5～10分钟,充分振荡后,用毛细吸管或吸血管吸取,滴入血细胞计数板内,按白细胞计数法计数四角4大方格内的细胞总数。注意仅计数胞核与胞浆完整的细胞,成堆的细胞按一个细胞计算。将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每ml细胞悬液中的细胞数:〖JZ〗每ml细胞数=〖SX(〗4大方格细胞总数〖〗4〖SX)〗×10000×稀释倍数根据细胞计数结果,再用营养液将细胞悬液进一步稀释为每ml含50万个细胞的浓度,即可装瓶培养。每个小试管或青霉素瓶装1ml,每个25ml容量的小瓶装4ml,每个100ml容量的长方形培养瓶装10ml。置36～37℃温箱内培养。鸡胚细胞在1～2小时内贴壁,几小时至十几小时后开始生长,24～48小时长成单层。此时即可更换维持液,并接种病毒。鸡胚细胞常用的营养液为:〖ZZ3〗生长液〖WX(!11KG7,5YQ〗05%乳白蛋白水解物〖〗97ml〖〗犊牛血清〖〗2～5ml〖〗抗生素溶液〖〗1ml〖WX)〗以碳酸氢钠溶液调整pH至72～74。〖ZZ3〗维持液〖WX(!11KG7,5YQ〗05%乳白蛋白水解物〖〗98ml〖〗醋酸钠溶液(240mg/ml)〖〗1ml〖〗抗生素溶液〖〗1ml〖WX)〗根据需要或细胞生长情况,加或不加1～2%犊牛血清,并以碳酸氢钠溶液调整pH至76左右。鸡胚细胞当然也可用人工综合营养液培养。各种组织的原代细胞培养,除常应用上述热消化方法外,也可用冷消化法,两者效果相同。方法很简单,即在普通冰箱中静止放置14～18小时,代替上述的37℃水浴消化。其它程序相同。若想将原代细胞培养物继续传代时,应于换液后1～2天挑选细胞形态好密度又大的培养瓶,倾弃营养液,经Hanks液洗2～3遍后,加入胰酶消化液少许(能将细胞单层面铺上一薄层为度)消化数分钟(其间不时摇动消化液),当看到细胞单层变白和出现空洞时,用手掌拍打瓶壁,此时细胞即很快全部脱落。先加入少量营养液,用吸管吹打分散细胞后,再按培养瓶原来液量的2倍加入新营养液,混匀并分装成两瓶后继续培养,即为继代培养细胞。原代细胞一般比较容易在继代培养中生长,但继续向后多次培养传代时,细胞往往生长不良,并逐渐衰落死亡。2)仓鼠肾原代细胞:取10～14日龄的幼仓鼠,剪断颈动脉放血至死。用自来水适当冲洗,以除灰尘,置清洁搪瓷盘中,背向上,移入无菌室或无菌罩内,先后用碘酊和70%酒精充分消毒,用剪刀沿背中线剪开,并向四肢延展。更换镊子及剪刀,将皮肤撕向两侧,露出背部。再换剪刀,于肋骨后剪一长约1cm的切口,将镊子插入切口夹住肾脏,剪断附连物后,将肾移入灭菌平皿内。按同样方法取出另一侧肾。另一个更简单且较少污染的方法,是在将幼仓鼠颈动脉放血致死后,即在颈胸交界处全周地剪开皮肤,朝尾部方向撕下整个鼠皮。随即置清洁搪瓷盘内,并送无菌室(罩)内采肾如前述。随后在平皿内剪除附着在肾脏上的脂肪,并剥去肾包膜,用剪刀将肾平剪成两半,剪除肾盂部分,用Hanks液冲洗,移入广口玻璃瓶中剪碎,洗涤后加入025％胰酶消化。消化可在37℃水浴中进行热消化。也可将其置于4℃冰箱内作冷消化,一般在静置条件下冷感作14～18小时。消化后的操作和计数方法同前。通常作成每ml50万的细胞悬液。培养方法亦如前述。仓鼠肾原代细胞的生长液可用加有10%犊牛血清的05%乳白蛋白水解液,维持液的血清用量减半或减至2%～3%。人们目前乐于应用人工综合营养液。3)皮肤原代细胞:各种动物的皮肤均可培养,但以胎儿皮肤为宜。一般由腹部或后肢内上侧剪取皮肤,按上述方法进行冲洗、消化和培养。以025%胰酶于4℃冷消化18～20小时的效果较好。营养液为含30%犊牛血清的05%乳白蛋白水解物;或05%乳白蛋白水解物与E〖DK〗MEM的等量混合液,内含30%犊牛血清,pH72。维持液的血清含量减至20%。由于皮肤细胞的分散比较困难,胰酶消化后往往仍有较大的颗粒状组织块,培养时经常悬浮于营养液内,不易贴壁,难于形成单层。现介绍一个简单而比较有效的方法。作者等试用于驴胎皮肤细胞的培养,较易形成单层:采取皮后将其切(剪)成1mm见方的小块,以大量洗液冲洗,吸干洗液后加入少量营养液。应用弯头大口吸管吸取营养液和组织块,注入培养瓶中,使每个100ml容量的培养瓶含有1～15ml的营养液和30～40个组织块,并用吸管头将组织块适当地分散排列。因为培养瓶内的营养液很少,组织块基本上暴露于空气中,仅使玻璃瓶的培养面保持于湿润状态而已。如果培养瓶内的营养液太多,组织块漂浮于其中,则应将多余营养液吸走。稍稍扭松瓶塞,置CO2温箱中,于37℃静置培养1～2小时,随即取出,塞紧瓶塞,以保持瓶内具有一定量的CO2。置37℃普通温箱内培养1～3天,此时多数组织块已经贴壁,即可沿瓶颈缓缓加入1ml营养液。此后每2～３天加一次营养液,每次加入1～3ml,直到加至10ml。如果细胞生长旺盛,常可一次加足至10ml。待其长成单层,即可换液,并接种病毒。换液时用力振荡,可使原来的组织块脱落,而仅留下生长旺盛的单层细胞。4)骨髓原代细胞:无菌采取动物(胎儿)长骨,折断后刮取骨髓,置营养液内用大口吸管充分吹打,收集混浊液体,移入另一灭菌瓶中,稍予沉淀(约1～2分钟)。此时瓶底有较大块状物的沉淀,液面则有油脂漂浮。另换吸管或连有针头的无菌注射器,小心吸取中层混浊液体,分装培养。24小时后观察,细胞已经贴壁,再待1天后换液。置低倍镜下观察,可见许多纤维样或长梭形细胞,并有大量圆形和短梭形细胞分布其中。这是骨髓中造血干细胞和结缔组织细胞等多种细胞的典型混合图象。此时接种病毒,病毒选择性地在敏感细胞内生长,而不敏感细胞则常继续增殖。培养豚鼠、仓鼠等小实验动物的骨髓细胞时,可先剪去长骨两端,随后用注射器吸取营养液,压入长骨腔,冲洗出腔内的骨髓细胞,吹打混合培养。骨髓原代细胞的营养液可以选用①全犊牛血清;②犊牛血清与05%乳白蛋白水解物的等量混合液;③犊牛血清与199或E〖DK〗MEM的等量混合液。pH为72左右。5)马属动物原代白细胞:可在体外玻璃瓶内贴壁培养的白细胞,其实只是血液中的巨噬细胞,即大单核细胞。多形核细胞虽可贴壁,但于3～6天内自行脱落。淋巴细胞不贴壁,一般只作悬浮培养。由于马属动物的血沉很快,因此容易由静置的抗凝血液的血浆部分取得白细胞,不必采用特殊的白细胞分离技术。先在采血瓶内按采血量加入肝素溶液,并置冰箱内适当预冷(以减少白细胞对采血瓶的贴壁)。由动物颈静脉采血,摇匀后尽快置4℃冰箱内,静置30～40分钟,待红细胞完全沉淀后,用吸管小心吸取上层血浆,置离心瓶(管)中,加入Hanks氏液或Earle氏液,振荡混合后,以1000r/min的速度离心沉淀10分钟,倾弃上清液,加少量洗液,悬起沉淀细胞,充分混匀,再加洗液至满瓶,以800r/min的速度离心沉淀10分钟。倾弃上清液,加入牛血清,以吸管充分吹打,混匀后进行细胞计数,最后稀释为每ml含细胞1000～2000万个。装瓶培养,1～2小时后细胞贴壁,24小时后可见细胞出芽,此时或再待12～24小时后换液,同时接种病毒。应用牛血清培养马属动物白细胞,存在一个所谓的“对号”问题,也就是某批牛血清适于某匹或某几匹马、骡、驴的白细胞的培养,但用于另一匹或另几匹马、骡、驴的白细胞即不能获得良好的培养结果。因此必须事先试验各批牛血清与各该动物白细胞的适合性。根据我们的经验,以2～3头牛的混合血清较好。培养马和骡的白细胞,最好应用犊牛血清,驴白细胞的培养要求稍低,可以应用成年牛血清。也可分别应用含血清50%和20%的199人工综合营养液、E〖DK〗MEM营养液作为生长液和维持液。有人建议生长液中的血清含量不要超过20%,据云血液巨噬细胞在这种营养液内的发育较慢,但可以长期活存达几周之久(于5%CO2环境中)。血液中淋巴细胞的培养,可按上述同样方法制备白细胞培养悬液,并用营养液将其进一步稀释成每ml约含2000万细胞的浓度。倾入灭菌平皿或培养瓶内,液面厚度不超过2～3mm,37℃静置培养一小时。随后吸出上层液,注入另一灭菌平皿或培养瓶内,如上37℃静置培养一小时。由于单核巨噬细胞、多形核白细胞等均已吸附于玻璃表面,吸取的上层液中主要就是淋巴细胞。用营养液将其稀释成1106～7个细胞/ml,即可分装培养。营养液为PRMI1640,内加20%犊牛血清。置5%CO2环境中培养,约可活存2周(此时活细胞约占细胞总数的50%～55%)。如在营养液内加入植物血凝素(1～30μg/ml),可使淋巴细胞激活,并分化为母细胞,显微镜下可见出芽和增殖现象。6)猪、牛等动物原代白细胞:猪、牛及其他血沉缓慢的动物的白细胞,不能应用静置抗凝血的方法。因此,必须采取相应的措施,才能取得白细胞。采取肝素抗凝血如前,立即加入等量的犊牛血清或1/5量的6%葡聚糖PBS溶液,4℃冰箱静置1小时,吸取上层血浆,如上收集白细胞、洗涤和培养。由于葡聚糖的分子量不同,而各种动物血液成分的比重也不尽相同,因此必须通过预备试验,调整葡聚糖溶液的浓度或其加入量,务使红细胞在静置时较快下沉,上层血浆中含有较多的白细胞。上述的葡聚糖浓度及其加入量是指分子量为184000的葡聚糖。作者等采用馏水裂解红细胞的方法,成功地分离和培养了猪和狗的血液巨噬细胞。具体方法是采血于盛有玻璃珠的脱纤瓶内,充分振摇脱纤。随后将脱纤血吸入或倾入另一离心沉淀瓶(管)内,以1500r/min的速度离心沉淀15分钟,吸出上层血清,保存备用。于沉淀血细胞中加入12倍容量的三馏水或去离子水,充分振荡混合,再以1200r/min的速度离心沉淀12分钟,小心倾出黑红色溶血液,瓶底留下6～7ml底液(指50ml离心瓶)。再加馏水10ml,振荡混合后立即加入洗液至满瓶,再以1000r/min的速度离心沉淀10分钟。届时取出,可见瓶底有白色或红白色沉淀细胞。如红细胞太多,可倾弃上清液,并加洗液至满瓶,再以900r/min的速度离心沉淀10分钟,即可获得白色的细胞沉淀。加入少量营养液,充分振荡混合,经细胞计数后再行稀释为每ml含1000～2000万个细胞的细胞悬液。猪、牛、狗及其他动物的白细胞也可用全犊牛血清培养,或者应用犊牛血清和199人工综合营养液(或PRMI1640)的等量混合液。维持液中的血清含量减至20%。血液中白细胞的分离方法颇多,例如葡聚糖-泛影葡胺分层法、明胶沉淀法和玻璃纤维(玻璃珠)吸附-洗脱法等等。这些方法或则操作比较复杂,易于污染,或则只适用于小量血液样品中白细胞的分离,病毒实验室较少应用。②二倍体细胞株培养:二倍体细胞株的增殖代数与其来源动物有一定关系,如人胚肺细胞株可传50代或更多的代数,而马和牛的胚胎细胞株的传代次数较少。医学上很重视二倍体细胞,如由人胚胎建立的成纤维细胞株,广泛用于人类病毒病的诊断、药物筛选和疫苗制造。特别是人用疫苗生产,医学上大多使用二倍体细胞。但美国最近批准使用Vero传代细胞系生产人用狂犬疫苗。来源于动物组织的二倍体细胞株也不少,但目前应用不广泛。兽医实验室包括生物制品厂一般多应用原代细胞和传代细胞系,但疫苗生产最好不用传代细胞系。一些实验室常根据需要自行培育继代细胞株。我们实验室就曾建立过马属动物的传代细胞株。传代细胞株使用的营养液与其原代细胞培养基本相同,不再赘述。现就如何建立二倍体细胞株作扼要介绍。建立细胞株不是一件轻而易举的事,特别是从3代到7、8代是最不稳定时期,细胞很容易丧失贴壁、增殖能力而衰落死亡。在建株培养传代过程中,主要应注意以下几点:原代细胞培养的组织尽可能取自动物胚胎或新生动物,并立即培养;实验设计出最适于该种细胞的生长液和维持液配方,其营养成分应适度丰盛,尤其在生长困难的前期;传代时选用合适的细胞分散剂,尤应注意消化的时间不要过长;传代时接种的细胞数要比一般高05～1倍,宁多勿少,视情况可一瓶传一瓶,或两瓶传一瓶,而且一定要利用原瓶(原瓶比新瓶更适于细胞生长);要根据组织来源和动物种类,选择适合的培养温度;培养过程中要根据继代细胞的形态、增殖程度和营养液的pH等,适时地进行换液和传代,应在细胞生长最旺盛、形态最好的时候传代,不要错过时机,此点尤为重要。为了提高细胞的适应性和成活率,可在原代培养中故意加入一些组织块(可取自消化后残剩的小组织块)与单个细胞同瓶培养。这些组织块大部能像单个细胞一样贴壁,并在其周围呈放射状地长出细胞。下次传代时,仍将残留的组织块消化下来后继续培养,直至消失。另外,在培养过程中如发现细胞生长不太好,但又到了换液的程度时,可置换部分新液,而残留1/4～1/2的旧液,以利于细胞的适应性和增殖。经过5～7代培养,生长良好的继代细胞,应大量冻存于液氮中备用。在继代过程中,每间隔8～10代,应对细胞的染色体组型进行检查,看其是否仍保持二倍体状态。如果发现染色体组型已经改变,表明细胞在传代过程中已发生突变,成为可以无限期增殖传代的细胞系。③传代细胞系培养:传代细胞系种类繁多,其中多数来自人和动物的肿瘤组织,部分来自发生突变的正常细胞,它们丧失和改变了原细胞固有的特性,变成了能长期在体外培养传代的异倍体癌变细胞。传代细胞系的优越性不仅在于可以无限的传代,而且不少细胞系对病毒也很敏感,尤其是某些传代细胞系能在悬浮培养条件下增殖,适合病毒抗原的大量生产。传代细胞系不仅容易培养,而且生长旺盛,繁殖快速,对营养条件不苛求。但很多传代细胞系在长期传代过程中遭到支原体和病毒的污染,特别是支原体更为常见,从而影响实验的科学性和准确性,这是在使用传代细胞系时必须注意的问题。兽医病毒学实验室常用的传代细胞系种类很多,如我们实验室经常保有Vero(非洲绿猴肾细胞)、BHK〖DK〗21(乳仓鼠肾细胞)、MDCK(犬肾细胞)、IBRS〖DK〗2(猪肾细胞)、F81和MA〖DK〗104(猫肾细胞)、FL(人羊膜细胞)及HeLa(人子宫颈细胞)等细胞系。不用时保存于液氮罐中,用时取出培养复苏。农业部兽医药品监察所和国家卫生部生物药品检验所均保存有多种传代细胞系和二倍体细胞株,对外实行有价供应。传代细胞系的培养方法基本相同。各种人工综合营养液和乳白蛋白水解物均可用作营养液的基础。1)猪肾传代细胞:在现有的一些猪肾细胞株中,既有经过严格鉴定并低温保存的二倍体细胞株,也有已经发生恶性变,丧失原来正常的二倍体组型而成为所谓异倍体的传代细胞系。但是它们的营养液和传代方法基本相同。取已长成单层的猪肾细胞,倾弃原来的营养液,最好再用Hanks液等冲洗一次。加入002%EDTA溶液或05%胰酶和004%EDTA溶液的等量混合液,其加入量以能在单层细胞上形成1mm厚的液层为宜。置室温或37℃温度中消化5～30分钟(随细胞种类而不同),当细胞层开始由瓶壁剥离时,即可将消化液倾出,并加入少量营养液,轻晃冲洗细胞层后倾弃,再加相同于原营养液量的新营养液,以大口吸管充分吹打,直至细胞完全分散,再加同量营养液,吹打数次后即可分瓶。为便于吹打和分散细胞,开始时可少加一些营养液,吹打分散后,再逐步追加营养液至所需量。其分种率为1∶2,即由1瓶传为2瓶。有时分种率可提高到1∶3或1∶4。第2～4天换液,在快长成单层时接种病毒。生长液为E〖DK〗MEM与05%乳白蛋白水解物的等量混合液(也可分别单独使用),内含抗生素和10%犊牛血清,pH72。维持液的成分相同,仅其血清含量减少至5%或2%,并提高pH至76。2)Vero细胞:它是一种兽医病毒学实验室应用较多的细胞,不仅对多种病毒敏感,而且容易培养,增殖快速,性质稳定。培养传代时,取已形成单层的细胞培养瓶,倾弃维持液,用Hanks液洗2～3遍后,加入025%胰酶溶液,加入量约为原营养液量的1/3,室温或37℃水浴消化,待细胞面开始脱落时,即可翻转培养瓶,并倾去大部分胰酶溶液后,再行翻转培养瓶,让残留胰酶溶液继续呈现消化作用,并如上加入新营养液,吹打和分装。细胞生长良好时,可以1∶3的比例进行传代,即1瓶传3瓶(每ml含细胞30～40万)。生长液为〖DK〗EMEM与05%乳白蛋白水解物的等量混合液(也可分别单独使用),内含10%犊牛血清,pH72。维持液的成分同上,但血清含量减半(或减2/3),pH提高至74～76。3)白纹伊蚊C6/36细胞:这种细胞很容易生长,并对多种虫媒披膜病毒敏感。取已形成单层的细胞培养瓶,倾弃营养液,用Hanks液洗1～2遍,加入约原液量1/3的E〖DK〗MEM综合营养液(pH68),然后用大口吸管吹打,使瓶壁上的单层细胞脱落并分散为单个细胞。最后按原营养液量的4倍补足营养液,混匀,分装为4瓶(即1瓶传4瓶)。培养瓶置28℃培养。每周传1代。④微量培养板培养和转瓶(管)培养:这两种培养均属于单层细胞不同的培养形式,扼要介绍如下。1)微量培养板培养:是60年代开始应用的。各种细胞尤其是传代细胞系在微量培养板上能获得良好生长。微量法的优点不仅是节省材料,而且能增多重复试验的份数,提高实验结果的准确性。可应用于病毒分离、毒力滴定、中和试验、荧光抗体和酶联免疫吸附试验等。但微量法对原代细胞培养的效果较差,尤其是血液巨噬细胞。微量培养板为塑料制品(带盖),每板含不同数量培养孔,以40孔、96孔的多用。每孔容积为03～05ml,加入的培养液量为其容积的1/3～1/5(一般为01ml)。孔底有平面和球面两种,如需镜检以平底为宜。目前多应用国产聚苯乙烯微量培养板。将稀释好的细胞悬液,用定量移液管或微量滴管向每孔加入01ml,加盖后置5%CO2温箱内培养。24～48小时后用倒置显微镜观察细胞生长情况,如已长成或基本长成单层,即可换液接毒。微量培养应着重注意以下几点:首先是要掌握好接种的细胞数,不宜过多,以每孔接种1～2万个细胞为宜;其次是血清质量要好,而且要适当加大营养液中的血清含量,可较一般培养提高约50%;再次是要认真搞好培养板的消毒处理,准备工作周到,操作快速准确。如无CO2温箱,可在滴加细胞悬液后立即用透明胶纸带密封整个培养板的表面,防止孔中营养液蒸发、变碱或污染。也可在将微量培养板加盖后,用普通的橡皮胶布密封其四周,并置于点燃蜡烛的干燥器内(可产生5～10%的CO2)。2)转瓶(管)培养:使贴壁的单层细胞并不始终浸泡于培养液中,有利于细胞的新陈代谢,从而获得更为旺盛增殖的细胞。特别是转瓶培养能充分利用整个瓶壁表面,使其长满细胞单层,能生产出高效价的病毒制品。作大量细胞培养时,常用1万ml优质细口圆立瓶,每瓶接种细胞悬液1000～1500ml,混匀,放转瓶机(每小时转8～10周)上培养,24～48小时后用特制显微镜观察细胞生长情况,如已长成或基本长成单层,即可换液接毒,当然也可在细胞培养当时同步接毒。转管培养应用特制的自动旋转鼓,将培养管放入鼓孔中,将鼓置37℃培养。旋转鼓适于多管小量培养,用作某些病毒的分离和鉴定等。(2)悬浮细胞培养:为能获得大量均匀生长的细胞悬液,早在20多年以前,人们就已开始探索细胞悬浮培养的方法。最先是用旋转瓶或旋转鼓,以每分钟40～50转的速度强使细胞不能贴壁而呈悬浮生长。后来又改用搅拌的方法,使细胞维持在悬浮状态。一般来说,活细胞都有可能在悬浮状态下生长。但是必须指出,同一株细胞中的某些细胞可能更加适应悬浮培养,例如Parker的实验室曾从猴肾细胞培养物中选育出一株可在静置培养条件下自发地呈悬浮生长的细胞株,也曾有人从L细胞和HeLa细胞中选出自发的悬浮株。近年来广泛应用于口蹄疫疫苗生产的乳仓鼠肾传代细胞株BHK〖DK〗21克隆13,也是一株适于悬浮培养的细胞株。但原代细胞和二倍体继代细胞都难以在悬浮状态下生长。由于大规模培养哺乳类动物细胞是生产多种生物制品的重要方法,近年来很多先进国家都投入了巨额的资金和人力,重点设计研究在各种不同悬浮状态下大量培养细胞的设备和方法,成为新兴的细胞工程的一个重点开发方向,新设计的各种培养罐不仅完全自动化,而且容量大的已超过1万升。当前这方面研究处于领先地位的是英国Celltech公司研制的全自动、密封的气升式深层培养系统。其原理是,混合气体自培养罐底管道进入,顺中央内管上升,部分气体从罐顶逸出,另一部分气体沿管内缘下降,直达罐底和新吹入的气体混合后再度上升。就这样借助气体的不断上下循环搅动营养液,不使细胞贴壁。整个操作都由电子计算机程序控制。种入细胞后培养3～4天,每ml细胞数可达25106个以上。细胞悬浮培养时,必须掌握下列几个关键问题。①由于细胞生长旺盛,每ml营养液负担的细胞密度明显高于单层培养细胞,因此,氧和营养成分的供应必须十分充足。一般应用双倍浓度的氨基酸和维生素,例如2倍浓度的E〖DK〗MEM,另外添加血清和细菌培养用蛋白〖HT5,7SS〗月〖KG-*4〗〖HT5,7SS〗示〖HT〗等营养补充剂,而且经常是在培养过程中多次追加新的营养液,以保证细胞生长代谢的需要。空气由自动控制装置经滤器过滤后输入。营养液的酸碱度,由pH自动调节器调节二氧化碳输入量控制。②为保证所有细胞都能获得足够的氧和营养成分,也是为了避免细胞沉淀,培养液必须处于快速搅拌状态下,一般是每分钟搅拌300～500次。同时可在营养液内添加少量甲基纤维素,增高营养液的粘度,以利细胞保持在悬浮状态下生长。③由于细胞在迅速增殖以前,必须先对营养液作“条件化”改变,只有这种“条件化”了的营养液才能保证和促进细胞大量增殖。因此,开始接种时的细胞数需有足够的浓度,以利细胞对营养液进行“条件化”。一般的做法是在开始接种时少用一些营养液,使接入细胞具有较高的浓度,当细胞增殖达一定数量时,再行加入全部营养液。④不言而喻,细胞培养罐的所有部分,特别是各个部件和装置的接头部分和传动部分,必须严格密闭,以免发生细菌和霉菌性污染。⑤细胞培养过程中,必须定期采样,进行细胞计数,并测定细胞活力,计算活细胞在细胞总数中的百分率,一般要求至少在90%以上。具体有两二种方法:1)用去离子水配成2%台盼蓝溶液,以1500r/min的速度离心沉淀10分钟,吸取上层液作为染色液。于1ml待检细胞悬液中,加入05ml染色液,混合后进行计数,活细胞不着色,死细胞则被染成蓝色;2)用去离子水配成1％中性红溶液备用。计数细胞时再用Hanks液稀释10倍,以1500r/min的速度离心沉淀10分钟,吸取上层液作染色液。于08ml待检细胞悬液中加入02ml中性红溶液,混合后置室温感作15～20分钟后计数,活细胞吸收中性红呈红色,死细胞不着染。(3)微载体细胞培养:利用微载体培养动物细胞是1967年VanWezel首先创立的。其原理是利用对细胞无毒性的微小颗粒,按一定比例放入混悬培养的营养液中,作为细胞附着增殖的载体,从而显著扩大细胞长成单层的附着面,充分利用生长空间和营养液,达到大大提高细胞产量的目的。微载体培养的细胞既在载体表面形成单层生长;但为了不使载体沉淀,又要不断搅拌,使载体保持悬浮状态。可见微载体培养是单层细胞培养与悬浮培养相结合的方法。当前利用微载体已成功地培养了上百种动物细胞,其中不仅传代细胞系,而且能使悬浮培养不能生长的很多原代细胞和二倍体细胞良好生长,其单位容积的细胞产量比一般单层细胞培养高10倍,甚至几十倍。因此微载体法应用前景广阔,不仅可用于生产疫苗、病毒抗原、干扰素和单克隆抗体等,也是生产基因重组产品的重要手段。据有关实验资料,多种病毒均可适应微载体细胞培养,尤其是某些在常规方法生长不佳的病毒,可用此法获得改善。曾有一则猪瘟病毒微载体的培养报道:在200ml营养液中加入1支CytodexⅢ微载体,PK15细胞在8小时培养后全部贴壁,细胞总量达54×107,相当于9个表面积为175cm2培养瓶所获的细胞量。接种猪瘟弱毒Alfort187株后48小时,毒价高达1092TCID50/ml,较常规法的病毒产量高出10倍以上,而且还能节省大量的营养液和血清。微载体培养的关键是微载体和相应的带搅拌的特制培养装置。微载体是用对细胞无毒性的葡聚糖等材料制成的可供细胞贴壁生长的微粒,干燥的微粒直径40～150μm,浸泡营养液后膨胀到60～250μm,既小又轻,表面积大,在1ml营养液中5mg微粒的总面积可达30cm2,因此能获得很高的细胞产量。另外还有一类用无毒性聚苯乙烯为原料制成的微载体,直径160～300μm,它的特点是在液体中不膨胀。目前商品化的微载体种类很多,国产的如CT1、CT3、GT2(华东化工学院)、MC1(军事医学科学院),进口的如CytodexⅠ、Ⅱ、Ⅲ,Biocarrier,Gelibead以及DEAE纤维素和以聚苯乙烯为原料的Biosesilon等。据实验资料报道,当前应用较多效果较好的是瑞典产的CytodexⅠ、Ⅱ、Ⅲ型微载体(其次是丹麦产的Biosesilon微载体)。使用前用蒸馏水泡胀,1g干载体加50mlPBS悬浮,高压灭菌后保存于普通冰箱中备用。1gCytodexⅠ约提供06m2细胞贴附面积,其密度为103g/ml。微载体培养的细胞密度:传代细胞系一般约为2×105个细胞/ml,但原代细胞和二倍体细胞株应适当加大细胞密度。微载体浓度一般为1mg/ml,为了提高细胞产量,有时可提高到每ml含3～5mg。将加完细胞和微载体的培养瓶(带磁搅拌棒,有的带有通气装置)放在特制瓶架上,置37℃培养,搅拌棒的转速每分钟约60～80转。通常经6～8天,载体表面即可长出致密的细胞层,用维持液洗两次后,换液接毒。进行微载体大量细胞培养时,目前多应用悬浮细胞培养瓶或发酵罐,自动调节pH和通气(最适氧压160mmHg),最高细胞产量已达2×107个细胞/ml。近年美国Bellco公司设计出一种新型大载体培养系统,专供大规模培养细胞应用。这种大载体是由海藻酸钠构成的,它在钙溶液中形成适于细胞附着的网络状凝胶珠。大载体培养系统设备复杂,只适用于大型实验室和生物制品厂。(4)无血清培养:无血清营养液可用于单层和悬浮细胞培养等各种培养方法。从培养细胞类型讲,无血清营养液虽可用于培养原代细胞、二倍体细胞和传代细胞,但以后者易于成功,目前这种培养方法主要用于传代细胞系。无血清营养液培养的关键是选择适宜的营养液和细胞。①营养液:不同种类的细胞对营养液的成分有不同的要求,不可能用一种营养液配方培养多种细胞。自行配制营养液时,需要通过培养实验确定添加物的种类和数量。可见这是一项比较复杂费时费事的工作。但目前已经有了便利条件,即市场上已能买到适于培养多种细胞的无血清营养基。可根据培养细胞的种类选择适宜的培养基配成营养液进行培养,也可通过实验从几种不同配方中选择出最适于该种细胞的营养液。②细胞:现在应用无血清营养液培养成功的细胞系已经不少,不下几十种,其中有:MDCK(犬肾上皮细胞),Hela(人子宫颈癌细胞),BHK(乳仓鼠肾细胞),GH3(大鼠脑垂体癌细胞),B104(大鼠神经母细胞瘤细胞),M2R(黑色素瘤细胞),C6(大鼠神经胶质瘤细胞),MCF7(人乳腺癌细胞),ZR75〖DK〗1(人乳腺癌细胞),F9(小鼠胚胎癌细胞),TM4(小鼠睾丸上皮细胞),HC84S(人结肠癌细胞),L6(大鼠肌母细胞),HLE222(人肺鳞癌细胞)和RF1(大鼠卵巢滤泡细胞)等。而且有些细胞系如ZR75〖DK〗1,HC84S和HLE222,它们在无血清培养液中的生长比在有血清培养液还好。HC84S细胞系在无血清培养液中能维持高密度分化状态,并形成绒毛样分泌结构。培养时选用上述细胞系尤其是已适应于无血清培养液的细胞,则更容易成功。需要指出的是,一般传代细胞从它已经适应的含血清营养液,转换为无血清的营养液,往往不是一下子能改变得了的,要有个逐渐适应过程。转换初期,营养液可由原含血清营养液和无血清营养液1∶1组成。根据细胞的适应程度,逐步减少原营养液比例,直至完全用无血清营养液所取代。

 

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