鸡胚(包括其它禽胚)是正在 发 育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵 黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易 于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作 简便易行。应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母 鸡垂直传递的病毒,如禽白血病病毒以及新城疫、禽脑脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。另外,胚胎 中往往含有因母鸡免疫而产生的卵黄抗体,影响同种病毒的增殖。因此理应选用SPF鸡群产的 蛋。虽然喂饲添加抗生素饲料母鸡的蛋中含有抗生素,但对病毒学实验通常无影响。病毒在 鸡胚中增殖,除部分病毒产生痘斑、引起充血、出血、坏死灶和死亡等变化外,许多病毒缺 乏特异性的感染指征,必须应用血清学反应或检查病毒抗原以确定病毒的存在。鸡胚实验 必需的器械主要有孵卵箱、检卵灯、卵盘、开卵钻、卵杯和羊膜腔接种用的照明灯等。操作 时要注意防止污染,选择适宜的接种途径和培养温度,并要认真观察,及时收获。鸡蛋孵育 前不要洗擦,因洗擦能除掉卵壳表面的胶质保护层,容易致发细菌感染。没有孵卵箱时,也可 用普通恒温箱代替,为保持40%～70%的相对湿度,于其下部应放一盛水盘。最适温度为38～39 ℃,并应每天翻卵1～2次。现扼要介绍常用的绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊和羊膜腔等四 种接种方法(图11-1)。〖JZ〗图11-1 鸡胚接种的途径
1.绒毛尿 囊膜接种〖HT5SS〗主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖,这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形 成痘斑或病斑。用10～12日龄鸡胚,在胚胎附近略近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器 在卵壳上烙出一个直径约3～4mm的烤焦圈,用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵壳,造成 卵窗,但不可损伤壳膜。在气室端中央也钻一个小孔。随后用针尖轻轻挑破卵窗中心的壳膜, 切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。滴加1滴灭菌生理盐水于剌破处。用橡皮乳头紧贴于气室中央 小孔上吸气,造成气室内负压,使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室,此时可见滴加 于壳膜上的生理盐水迅速渗入。用1 ml注射器滴入2～3滴接种物于绒毛尿囊膜上。最后用透 明胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗上,周围涂以熔化的石蜡密封之。气室中央的小孔可用 石蜡密封住。鸡胚在接种后,横卧于孵卵箱中,不许翻动,保持卵窗向上。绒毛尿囊膜接种 的另一种方法是在气室端的卵壳上开约15cm×15cm的口,并小心地用灭菌眼科镊子撕去 一小片内壳膜,切勿损伤其下的绒毛尿囊膜,随即滴入接种物,最后用透明胶纸封闭开口。
2.尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒和新城疫病 毒的分离和增殖,也是制备马 脑炎病毒疫苗的常用接种途径。选用10～11日龄的鸡胚,画出气室和胚位,在气室接近胚位处 涂抹碘酊和酒精进行消毒后,用钢锥穿一小孔,随后将注射器针头沿此小孔插入05～10cm 处 (避开血管),注入01～02ml接种物。最后用石蜡封口,并置孵卵箱中孵育。每天翻卵并检 卵 一次。24小时内死亡者废弃。但如上述,东方型和西方型马脑炎病毒常可在接种后的15～24 小时内致死鸡胚。另一个方法是在胚位附近没有血管处穿孔并注入接种物,但此时必须将 气室端稍向下倾,否则接种液甚至尿囊液可能从针孔中回溢出来。蜡封的方法同前。
3.卵黄囊接种主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。用6～ 8 日龄鸡胚,画出气室和胚胎位置后,垂直放置在固定卵座上,用碘酊和酒精消毒气室端,以钢 锥在气室中央锥一小孔,用灭菌注射器吸取含病毒悬液,沿气室端所穿小孔剌入约3cm,注入0 1～05ml接种物于卵黄囊内。随后用溶化的石蜡封孔,置孵卵箱内继续孵育,每天翻卵1～2 次 。24小时内死亡者废弃,但东方型和西方型马脑炎病毒可能在接毒后15～24小时内致死鸡胚 。
4.羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。在由病料初次分离病毒时 ,羊膜腔接种法比尿囊腔接种法敏感。但此法操作技术比较困难,鸡胚也易受伤致死。选用11 ～12日龄的鸡胚,按绒毛尿囊膜接种法造成人工气室,撕去卵壳,并剌破绒毛尿囊膜血管较少 的部位,用钝端镊子沿此破孔插入,夹起羊膜囊,注入01～02ml接种物。由于不易判断接 种 物是否被正确地注入羊膜腔内,故可将已经吸取了接种物的注射器的筒栓稍微回抽,使注射针 芯内含一个气泡。注射时将气泡和接种物一起注入。将卵适当倒转,即可清楚地看到气泡是 否 在羊膜腔内,以判定注射是否正确。另一个方法是在气室端中央开一个12cm直径的圆孔 。 用灭菌镊子揭去卵窗部位的卵壳和壳膜,并滴加1滴灭菌液体石蜡于内层壳膜上,使其透明。 如置检卵灯上观察,看得更加清楚。随后用灭菌弯头眼科镊子,剌破内层壳膜和绒毛尿囊膜( 避开血管!)并轻轻夹起羊膜使成伞状,并在直视下将注射针头插入羊膜腔内,直到碰着鸡胚或 看到胚胎突然向后退缩,证明针头已经到达羊膜腔内,即可进行接种。接种病毒后的鸡胚, 一般放37℃孵育,也有少数病毒如流感病毒则放置于33～35℃。除接种马脑炎病毒外,在24小 时内死亡的鸡胚均视作非特异死亡而废弃。培养时间也随病毒种类而异(参见病毒各论)。根 据接种途径的不同,收获相应的材料:绒毛尿囊膜接种者,收获接种部绒毛尿囊膜并注意观察 病变;尿囊腔接种者, 收获尿囊液(5～8ml),并于收获前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以 上,冻死胚胎,防止出血;卵黄囊接种者,收获卵黄囊或胚体;羊膜腔接种者,收获羊水(05～1 ml)。兽医病毒学实验中,除常用鸡胚外,有时也用鸭胚、鹅胚、火鸡胚和鹌鹑胚等进行病 毒分离、弱毒株培育、疫苗制造以及卵黄抗体生产等。鸭和火鸡的孵化期为28天,比21天孵 化期的鸡胚更有利于慢病毒的增殖。
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