白玉兰组织培养中的褐化控制
录入时间:2009-6-22 16:48:23
来源：海博
摘要：为探讨白玉兰组织培养中抑制褐化的方法，以白玉兰芽为试材，利用组织培养方法，研究了光照、取材季节、预处理、抗氧化剂、吸附剂等条件对褐化的影响。结果表明：黑暗培养有利于抑制褐化；冬季和春季取材褐化率较低，夏季取材褐化率较高；接种前分别用1000mg/L柠檬酸和1000mg/L硫代硫酸钠预处理外植体可防止褐化；向培养基中添加低浓度NA2S2O3，柠檬酸，聚乙烯毗咯烷酮（PvP ) ，维生素C ( Vc ）能有效降低褐化率。
关键词：白玉兰；组织培养；褐化控制
白玉兰为木兰科木兰属植物，花繁而大，美观典雅，清香远溢，是优良的观赏树种，常用于园林设计、庭院栽培等。白玉兰一般通过嫁接、压条、扦插法繁殖，但成苗率低，速度慢，数量少，成本高，栽培和扩大利用存在很大困难。可利用组织培养方式进行繁殖。但在组织培养过程中，容易发生褐化，致使组织培养的效率不高。有研究表明，褐化主要是由于多酚氧化酶将植物体内酚类化合物氧化形成醌而引起的。控制氧化条件，如改变光照强度可以减轻褐化。用抗氧化剂对外植体进行预处理、向培养基中添加抗氧化剂、吸附剂等能够抑制外植体褐化。目前，褐化是限制白玉兰大规模组织培养的主要因素，而关于白玉兰褐化的相关研究较少，为此，笔者研究了光照条件、取材季节、预处理、培养基中添加抗氧化剂、吸附剂对白玉兰组织培养中褐化的影响，旨在探讨有效抑制白玉兰外植体褐化的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为白玉兰芽，长度为2 cm ，采自河北科技师范学院内4 年生，生长良好的白玉兰植株。
1.2 试验方法
1.2.1 材料消毒与接种 将白玉兰芽先用洗洁精水浸泡20min ，再用流水冲洗lh ，在超净工作台上用体积分数为0.75 的酒精进行表面消毒30s，然后用体积分数为0.001 的升汞处理7~8min，再用无菌水冲洗4~5 次，最后用无菌吸水纸吸去材料表面的水分，接种到相应的培养基上。
1.2.2 培养基 基本培养基为MS + 0.5mg/L6-BA + 0.3 mg / L IBA 。
1.2.3 培养条件 培养温度为25 ℃ 土0.5 ℃ ，每天光照llh ，光照度2500h 或暗处理。1 , 2 , 4 取材季节分别于春季（4 月5 日）、夏季（6 月5 日）、冬季（11 月15 日）取材。冬季取植株上的枝条，在室内用0.25 mg / L 的GA3 催芽，使其逐渐解除休眠，待芽长度为2 cm 时接种。
1.2.5 药剂预处理将白玉兰芽分别在1 000 mg/L Na2S2O3, 1000mg/L 柠檬酸中浸泡6h ，然后消毒接种到基本培养基中。
1.2.6 培养基中添加药剂将4 月5 日采取的白玉兰芽分别接种于附加不同种类的抗氧化剂、吸附剂的基本培养基中（表1 ) ，观察药剂对白玉兰褐化的影响。
1.3 试验设计与统计分析
每个处理接种8 瓶，每瓶接2 个芽，重复3 次。接种15d 调查白玉兰芽的褐化和生长状况，计算褐化率。试验采用完全随机设计，试验结果采用DPS 统计软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同光照条件对白玉兰褐化的影响
分别在光照和黑暗条件下培养，白玉兰芽都发生褐化，但褐化程度不同（表2 ）。黑暗条件下，褐化程度较轻，外植体有一定生长，但较缓慢，褐化率为33.3 % ；而在正常光照条件下，褐化严重，部分外植体褐化死亡，褐化率为60 % ，极显著高于黑暗条件。由此表明，黑暗培养对抑制白玉兰芽褐化有一定作用。
2.2 取材季节对白玉兰褐化的影响
不同季节的白玉兰芽褐化程度不同（表3 ）。夏季（6 月5 日）取材的褐化率为60 % ，显著高于春季( 4 月5 日）和冬季（11 月巧日）取材的。从芽的状态来看，春季和冬季取材的生长状态好于夏季取材的。由此可见，从控制褐化的角度来考虑，白玉兰不宜在夏季取材进行组织培养。
2.3 抗氧化剂预处理外植体对白玉兰褐化的影响
白玉兰芽通过抗氧化剂预处理6h ，对抑制褐化有一定作用（表4 ）。两种药剂处理的褐化率均低于对照（清水）。用1000mg/L 柠檬酸处理效果比较好，褐化率为10 % ，外植体长势好，有新芽出现；用1000mg/LNa2S2O3处理褐化率为30 ％。
2.4 培养基中添加抗氧化剂、吸附剂对白玉兰褐化的影响
在MS + 0.5mg/L6-BA + 0.3mg/L IBA 培养基中添加适宜浓度的抗氧化剂、吸附剂有利于抑制白玉兰褐化。由表5 中处理1 一处理7 可以看出：添加低浓度（<500mg/L ）的Na2S2O3能抑制白玉兰芽褐化，而且促进外植体生长，其中50~100mg/L 为最佳浓度，浓度过高则不能抑制褐化。处理8~处理11 可以看出：向培养基中添加低浓度（<500mg/L ）的柠檬酸能有效抑制白玉兰芽的褐化，其中添加200mg/L 柠檬酸的效果最佳，白玉兰褐化率为O 。处理12 一处理15 可以看出：向培养基中添加低浓度(200mg/L ）的PVP 能抑制白玉兰芽的褐化，但高浓度PVP 不能抑制褐化。处理16 一处理19 看出：向培养基中添加低浓度（lmg/L ）的vc 能抑制白玉兰芽的褐化，但Vc浓度过高反而不能抑制褐化发生。在所选用的抗氧化剂、吸附剂中，Na2S2O3和柠檬酸抑制白玉兰褐化的效果好于PvP 和Vc。3 结论与讨论
3.1 黑暗培养可抑制白玉兰外植体褐化
将白玉兰在黑暗条件下培养其褐化率显著低于光照条件的。这一结果与其它植物上的研究一致。组织培养中，褐化是由于植物体内含有的酚类物质在酚氧化酶的作用下被氧化为棕褐色的醒类物质，醒又经过非酶促聚合形成黑褐色物质，从而毒外植体。酚类化合物合成和氧化过程中，需要许多酶的参与，其中有一部分酶的活性是受光诱导的，如多酚氧化酶（PPO ）在光照条件下活性提高。因此，黑暗培养可以抑制酶活性，从而减轻白玉兰外植体褐化程度。
3.2 春季、冬季取材可减轻白玉兰外植体褐化
由于春季、冬季白玉兰植株体内代谢活动较弱，其细胞内参与氧化反应的多酚氧化酶活性较低，因此，这两个季节取材褐化率较低；而夏季白玉兰生长旺盛，内部生理活性增强，其褐化程度严重。这一结果与张明丽等的研究一致。
3.3 接种前用抗氧化剂对外植体进行预处理可减轻其褐化
用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养可预防酚类物质的形成。本次试验利用1000mg/L 柠檬酸，Na2S203 浸泡白玉兰外植体有效降低了褐化率。抗氧化剂能清除由于外植体机械损伤而渗出的酚类物质和已被酚酶氧化的醒类物质，减轻褐化危害的作用。
3.4 培养基中添加抗氧化剂、吸附剂可减轻白玉兰外植体褐化
很多研究表明，培养基中添加抗氧化剂、吸附剂能减轻植物组织培养中外植体的褐化。本次试验发现，向培养基中添加低浓度的Na2S2O3，柠檬酸，PvP , vc 能有效抑制白玉兰褐化；Na2S2O3，柠檬酸的抑褐效果好于PvP ,Vc。
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