干扰素(Interferon)
干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白 质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。干扰素是在1 957年由Isaccs和Lindenmann发现的，他们用加热灭活的流感病毒和鸡胚绒毛尿囊膜一起孵 育后，把吸附有灭活病毒的绒毛尿囊膜的组织块分离出来，继续培养后，保留培养上清， 换以新鲜的鸡胚绒毛尿囊膜块，再培养过夜后，接种流感病毒，结果发现流感病毒的复制 受 到明显的抑制。说明培养上清中含有一种不同于流感病毒粒子的抑制因子，他们将其称为干 扰素(IFN)。这种因子是灭活的流感病毒作用于组织细胞后，诱导细胞产生的一种可溶性物 质，后者干扰了活病毒的增殖。在此以后的30多年里，关于IFN本质、功能及其作用方式 的研究一直是分子细胞生物学和病毒学研究的最令人兴奋的课题之一。实践证明，目前人们 所认识的IFN比人们最初想象的要复杂的多。人们发现，IFN不是单一物质，而是 一 个IFN系统。 抑制病毒的活性也不是IFN的唯一功能，IFN还具有控制细胞生长和 分化以及免疫 调节等重要功能。
(1)干扰素的种类干扰素系统普遍存在于生物界中，目前所知，所有 种类哺乳动物均能产生IFN ，根据IFN的动物来源的不同，可将IFN分为人IFN(HuIFN)、小鼠IFN(MuIF N) 、牛IFN(BovIFN)等。根据每种动物IFN的抗原特异性和分子结构不同将其分为α、β、γ三 个型别；但在家禽，Bijkmans等(1990年)认为只有α、β型，而无γ型。根据特定型内氨基 酸序列或组成的不同，又将型 分为不同的亚型，例如将HuIFNα分为α1、α2……或αΑ、αΒ……等亚型。在一特定 的亚型内，有个别氨 基酸发生自然或人为改变时，则在亚型右下角注明，如人在β型IFN中第17位的半胱氨酸 变为丝氨酸时，应注明为HuIFNβ17ser。由于目前已经能够通过基因工程的手段生产重组 IFN ，为了与天然IFN进行区别，分别以rIFN(重组)和nIFN(天然)表示。如人的IFN表示为 rHuIFN和nHuIFN，猪的IFN表示为rPoIFN和nPoIFN等。干扰素系蛋白质分子，分子量为20～100kDa，沉淀率低，100 000g 不能使其沉淀， 也不能透析，对胰蛋白酶和木瓜酶敏感 ，对 核酸酶稳定，60℃ 1小时 一般不能使其灭活，在pH3～pH10酸碱范围内保持稳定。对十二烷 基硫酸钠(SDS)有抵抗力，在制备IFN时，通常利用该特性采用SDSPAGE对IFN做最后一 步纯 化。 I FN是由宿主细胞基因组编码的，由于IFNα有许多亚型，也相应地存在着许多编码基因， 分 为两大家族，人的IFNα第Ⅰ基因家族(IFNαⅠ)有15～24个成员，其中部分为功能性基 因， 至少有9个是假基因，存在如此多的基因可能是动物在进化过程中通过基因复制和扩增产 生 的。IFNα基因都位于人第9号染色体的短臂上，其中一些呈前后 头尾相连排列，其它的也相互靠近，大部分基因已经测序。 IFNα第Ⅱ基因家族(IFNα Ⅱ)有4～6个成员，其中一个 为功能性基因，3～5个为假基因，和IFNαⅠ相似，位于人第9号染色体短臂上。HuIFN β基 因只有一个，也位于第9号染色体短臂上。 HuIFNγ基因也只有一个, 位于第12号染色体 长臂上。 HuIFNα、β基因内无内含子，而HuIFNγ基因内 有内含子。BovIFNαⅠ基因有10～12个成员，BovIFNαⅡ有约30个成员；猪PoIFNα Ⅰ至 少有10个成员，其中至少1个为功能性基因；小鼠IFNαⅠ至少有15个成员，9个为功能性 基因。牛 、马、猪分别有多个IFNβ基因，兔有2个IFNβ基因。人和动物IFN都属于分泌性蛋白 ， 因此IFN的基因结构与其它分泌性蛋白的基因结构有相似之处， 即由5’端非编码区、信 号肽编码区、IFN多肽编码区和3’端非编码区组成。 人IFN在细胞内的前体大多数为166个氨基酸残基，IFNαA为165个，IFN－γ为143个 。IFN具有分泌特性。 前体肽链中有20～23个氨基酸残基的信号肽，IFNα、β、 γ成熟蛋白大小分别为142或143、145和120个氨基酸残基。MuI FNα前体有166～167个氨基酸残基，RatIFNα有162个残基；MuIFNβ有161个，BovIF Nβ有 165个；MuIFNγ有136个，BovIFNγ有146个。IFN分子有的没有糖分子结合位点，有 的有1～3个糖分子结合位点，但是糖基化对于IFN的抗病毒功能是非必需的。IFN分子 中因型别和来源不同，半胱氨酸的数量和位置也不同, 因而形成一至数个二硫键, 二硫键的 形成对于IFN的生物学活性和结构稳定 性等是十分重要的。IFN分子一般需要具有完整的分子组成才能具有完整的生物学活性 ，但是 也有研究发现IFNγ在羧基端和氨基端缺失几个氨基酸，IFNα在羧基端缺失10～13个氨 基酸 时仍能保持其全部活性。
(2)干扰素诱生剂正常情况下，IFN基因受一种抑制物的作用， 表达处于抑 制状态。在诱生剂的诱导作用下可以发生表达。目前已经发现的IFN诱生剂有多种，主要分 为以下几类：
①病毒诱生剂〓病毒是最重要的IFN诱生剂。一般情况下，RNA病 毒 诱生IFN的能力较强，DNA病毒较弱，但DNA病毒中痘病毒的诱生能力较强，疱疹病毒的诱 生能力中等，如牛疱疹病毒。有些病毒如大鼠K病毒和马传染性贫血病毒等在体内或体外培 养细胞上不能诱生IFN，带囊膜的病毒比无囊膜的病毒的IFN诱生能力强，如DNA病毒 中痘苗病毒比腺病毒的IFN诱生能力强，RNA病毒中正粘病毒比呼肠孤病毒强。 病毒毒力 与IFN诱生能力也有一定关系，一般情况下，自然弱毒株和致弱株比野毒株的IFN诱生 能 力强，如新城疫病毒Mukteswar株、Lasota株和口蹄疫弱毒株均比其相应的野毒株强。 但痘苗 病毒强、弱毒株之间的IFN诱生能力无明显差异。淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒和脊髓灰质 炎病毒的强毒株反比 它们的致弱株诱生能力强。有些病毒灭活以后也能诱生IFN，如新城疫病毒和Rous肉瘤病毒 等 。有的灭活病毒甚至比活病毒的IFN诱生能力更强，说明病毒诱导IFN时不一定进行 复制。但另外一些病毒, 如森林脑炎病毒, 灭活后即丧失其IFN诱生能力。IFN的产生与病毒感染过程相平行，病毒感染后4小时IFN开始产生，病毒蛋白合成速率达 最大时，IFN产量达最高峰，然后逐渐下降。 病毒诱生IFN的机制尚不十分清楚。 病毒复 制时, 通过某些细胞内的毒性成分直接引起宿主细胞蛋白合成的抑制， 由于宿主细胞中的IFN抑制物为不稳定蛋白质, 其合成速度稍一降低就会导致其自身迅速 耗尽，从而使IFN转录活化因子与PRDⅠ和PRDⅡ结合，导致IFN的合成。病毒释放的 双股RNA 进入细胞后可直接诱导淋巴细胞等产生IFN(如呼肠孤病毒等)。 负链单股RNA病毒与其复 制过程中形成的正链RNA退火后形 成少量的双股RNA, 后者再刺激淋巴细胞和巨噬细胞产生IFN。
②双链RNA诱生剂〓双链RNA是另外一种重要的IFN诱生剂。 所有天然的双链RNA， 如 呼肠孤病毒、单链RNA病毒的复制形式以及噬菌体的双链RNA均是IFN 诱生剂。人工合成的双链多聚核糖核苷酸， 如聚肌胞(polyIC)， 也是十分良好的IFN诱生 剂。但是单链RNA和DNA、 双链DNA或RNA-DNA杂合子均不是IFN诱生剂。作为有效的IFN 诱生 剂，必须具备如下特点：①具有稳定的二级结构(如polyIC比polyAU的诱生能力强)；② 对核糖 核酸酶有较强的抵抗力；③分子量大，最小有效长度为100个核苷酸残基。其中对核酸酶 具有抗 性是IFN诱生能力的前提，如polyAU的硫磷酸衍生物具有核酸酶抗性，它比polyAU本身的IFN 诱生能力强。polyIC与聚阳离子如DEAE葡聚糖、甲基化白蛋白、鱼精蛋白、多聚赖氨酸 和组蛋白等复合后其诱生能力明显增强。双链RNA在多种细胞内是蛋白合成的抑制剂，并具 有细 胞毒性。因此，polyIC作为IFN诱生剂，其活性基础最可能是抑制不稳定的IFN抑制物 的合成，导致IFN的合成。polyIC在体内外 均具有IFN诱生作用，但在体内除了具有诱生IFN和抗病毒作用外，还有增高 毒素毒性、抑制网状内皮细胞系统活性以及导致胸腺萎缩等副作用。短期内重复注射, 还可 形成耐受现象， 其诱生IFN的量愈来愈低。
③代谢物诱导剂〓代谢激活物和抑制物是另一类重要的IFN诱生剂，代谢激活物如 促有丝分裂原、淋巴因子能够诱导未定型(没有受特异抗原刺激)的淋巴 细胞 产生IFNγ，特异性抗原可以诱导定型(受抗原刺激的)淋巴细胞产生IFNγ。肿瘤激动剂 ， 如肉豆寇酸、丁酸盐、 脱氧尿嘧啶等，能够在 不同细胞内诱导各种IFN。代谢 抑制物， 如mRNA和蛋白合成的抑制物，也可以诱导IFN的形成。
④其它IFN诱生剂〓细菌内毒素、布氏杆菌、李氏杆菌、沙眼衣原体、结膜炎因子、支原体、原虫、立克次氏体 和合成的多聚物如硫酸葡聚糖、硫酸多糖等都属于IFN诱生剂，它们的共同特征是具有细 胞 毒性，不同程度地抑制宿主蛋白的合成。除了大分子量的物质外，近年来发现，低分子量的物质如梯活龙(tilorone)等也是良好 的IFN诱生剂。Franchini等发现高剂量的维生素E可诱导肉鸡产生IFNα、 β。在诱生IFN过程中还有一种特殊的超诱导(superinduction)现象。它是指细胞在某种大分 子合成抑制物的适当作用下发生的一种诱生IFN合成增加的现象。如细胞在用polyIC和蛋 白合成抑制剂放线菌酮或mRNA合成抑制剂放线菌素D共同处理时，IFN产量比不加放线菌 酮时增加50～100倍。超诱导现象的原理是: IFN合成抑制物是不稳定的，其相应的mRNA 也 不稳定，而IFNmRNA却是相对稳定的，当加入polyIC时同时加入蛋白或mRNA抑制剂，抑 制物及其mRNA合成很快阻断，而IFNmRNA合成却继续进行，从而产生更多的IFN。
(3)干扰素的生物学活性1957年发现IFN时，抗病毒活性被认为是其唯一活性。以后的研究 发现 ，IFN除了具有抗病毒活性外，还具有免疫调节、抑制细胞分裂和抗肿瘤等生物学活性。
①抗病毒活性〓IFN具有广谱的抗病毒作用，表现在病毒增殖量减少，细胞损伤程度降低 。IFN的抗 病毒活性较高，1mg纯IFN约有2×108IU，每10个分子就可以使1个细胞产生抗病毒状态。 但是IFN的抗病毒作用是抑制病毒的增殖，而不是将病毒杀灭。一旦从培养细胞中除去IFN ，病毒会再度增殖起来，只有用足够浓度的IFN反复处理，才能从培养细胞中将病毒 消除。 干扰素对病毒增殖的抑制作用与IFN的浓度成正比。IFN的抗病毒活性具有相对的种属特异性，一般情况下，IFN在产生IFN的同种细胞 上的活性大于异种细胞，如鸡的IFN只在鸡细胞上发挥作用，但在某些不同种属动物间也 存在着交叉活性。如牛和兔之间，人、猴和兔之间，家兔、小白鼠和地鼠之间，人、牛和猪 之间，鸭和其它水禽等之间均存在程度不同的交叉活性。在IFNα、β和γ中，IFNγ的 种属特异性较高，IFNα、β相对较低。同一动物的不同类型细胞对于IFN的抗病毒活性的敏感作用也不相同， 如小鼠胚胎原 代成纤维细胞对小鼠IFN的敏感性不及小鼠的L细胞系。不同病毒对IFN抗性作用的敏感性也不同。在同种机体或细胞内，RNA病毒对IFN较敏 感，而DNA病毒相对地不很敏感。RNA病毒中，披膜病毒对IFN的作用最敏感，禽流感病毒、 水泡性口炎病毒(VSV)中等敏感。同种病毒的不同变种和不同毒株之间对IFN的敏 感性也不同。多数报道认为，天然IFN与基因工程IFN的抗病毒活性对不同的病毒株基本 一致。IFN对急性病毒感染和慢病毒感染的作用也不相同。如用IFN对VSV感染细胞进行反 复处理，可使VSV最终消失，而当用IFN对小鼠白血病病毒感染的ADR细胞进行反复处理时 ，病毒及其相关的活性在有IFN存在时受到抑制，IFN去除后，病毒会重新复制。
②免疫调节活性〓免疫系统细胞在受到抗原或促有丝分裂原或肿瘤细胞等 刺激 时或在自发情况下可以产生IFN，如产生IFNγ及少量的FNα、β， IFN能够 增加淋巴细胞表面某些组织相容性抗原、β2微球蛋白和IgG Fc受体的表达，从而可以调 节多种免疫反应。如IFN可以增加L1210细胞表面H2d的表达，用该细胞免疫小鼠后，小鼠 血清抗体的吸收能力增强。人单核细胞受IFN作用后，HLA和β2微球蛋白表达增加；IFN γ作用于单核巨噬细胞后，细胞表面IgG Fc受体明显增加，其相应的功能如单核细胞的 免疫清除、巨噬细胞的吞噬作用等也增强。鸡脾细胞产生的IFN能够使鸡巨噬细胞活化 。IFN可以调节T细胞的功能，抑制迟发型超敏反应的发生，在体外还发现IFN可以抑制 有丝分裂原对T细胞的转化反应， 说明IFN抑制细胞毒性T淋巴细胞克隆的增殖，同时增强 成熟T淋巴细胞的功能。IFN直接作用于B淋巴细胞时，小剂量可以促进抗体反应，大剂量则抑制抗体反应，这 种相反作用的调节与IFN处理的时间也有一定关系。报道认为，大剂量IFN具有阻止前体B细 胞激活和克隆扩增的功能。IFN还可以增强NK细胞的活性，从而达到增强NK细胞在抗病毒和抗肿瘤方面的功能。IFN的抑制细胞分裂活性表现在体外抑制细胞的有丝分裂，尤其是对生长快的细胞的抑制 作用相对明显。 体内注射IFN，机体中切除组织的再生作用被明显抑制；新生动物注射 IFN后生长缓慢。长时间应用治疗剂量的IFN，粒细胞、血小板以及网织红细胞数量等下降 ，但这种抑制作用是可逆的，停止注射后，细胞数量恢复正常。
③抗肿瘤活性〓这种活性可能是上述各种生物学活性的综合作用结果。如IFN 能够抑制肿瘤病毒的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，并调动机体的免疫系统，如通过促进吞噬 细胞 的功能，增强NK细胞的活性等，杀伤肿瘤细胞。另外，IFN还可以通过调节癌基因的表达 实现抗肿瘤的作用。除上述IFN的主要生物学活性外，它还对病毒以外的微生物如衣原体、支原体、原虫及其 它细胞内寄生菌等具有抑制作用。
(4)干扰素的作用机理IFN是由宿主细胞编码的蛋白质，但是IFN本身并不直接灭活病毒， 而是作用于 靶细胞，通过激活靶细胞内的基因发挥其活性， 因而具有抗广谱病毒的作用。IFN首先作用 于细胞膜上 的受体，IFN－α、β的受体相同，IFNγ具有其独自的受体。IFN作用的种属特异性 决定于其受体系统，不同动物之间的IFN受体不同。IFN与受体结合后，发生内在化 并降解，导致“抗病毒蛋白”操纵子去抑制，转录mRNA并合成抑制病毒转录或翻译的抗病 毒蛋白，使靶细胞处于抗病毒状态。近年来的研究发现，IFN是通过激活IFN刺激基因中的IFN刺激反应区段而发挥其功能 的，在IFN刺激基因的－136～－167区段，其序列高度保守，可被IFN诱导。目前发 现 IFN在被细胞内在化和降解后，形成3种特异性因子，分别称作IFN刺激基因因子1、2 、3。这3种因子与相应的IFN刺激反应区段结合后，去除抗病毒蛋白基因的转录抑制。迄今发现的由IFN刺激基因编码的蛋白有3类，一类是寡腺苷酸合成酶，它能使ATP聚合成2 ’，5寡腺苷酸。IFN对该酶的这种刺激作用，利用重组猫IFN在猫体内也得到了证实 。2’，5 寡腺苷酸被磷酸化后具有激活核糖核酸酶(RNase L)的作用。人们证明，当用IFN处理细 胞时，RNase L水平增高20倍以上，但是RNase L的作用无特异性，它可以同时降解病毒及细 胞 RNA。其降解病毒RNA的特异性可能是由2’，5寡聚腺苷酸在病毒感染局部的高浓度决定 的。但是近 年来赵小侠等(1988年)、Meurs等(1989年)和Lewis等(1981年)的研究分别表明，2’，5寡 腺苷酸并不一定与IFN的抗病毒作用相关。另一类是67kDa蛋白激酶系统。当用IFN处理细胞时，67kDa蛋白水平可增高20倍，在正常 情况 下为非活性状态，在微量dsRNA作用下或病毒感染时，发生自动磷酸化激活，同时使蛋白合 成起始因 子eIF2的小亚单位磷酸化，抑制蛋白的合成。但是67kDa(人为68kDa)蛋白激酶也存在着是 否具有病毒特异性的问题。如某些细胞虽然在IFN诱导下处于抗 病毒状态，但无该酶或2’，5寡腺苷酸合成酶的合成，某些细胞中具有67kDa蛋白激酶， 可以 对抗某些病毒的感染，但对另外一些病毒却无作用。在人的某些成纤维细胞株中，IFN 诱导了2’，5 寡腺苷酸合成酶的合成并使细胞处于抗病毒状态，但却无67kDa蛋白激酶的合成。很明显，I FN抗病毒的分子机制是十分复杂的。近年来发现，由α、βIFN诱导哺乳动物细胞产生的Mx基因产物是抗流感病毒感染的蛋 白质成 分。该基因已被克隆，其启动子可被IFN或病毒感染等诱导。Mx蛋白不仅在细胞上，而且 在转基因小鼠体内均证明具有抗流感病毒的作用，但对其它病毒无抗性作用。
(5)干扰素的应用IFN在医学临床上已经开始应用。对于人鼻病毒、带状疱疹病毒、流感病 毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒等感染均具有明显的治疗效果。在动物，发现给牛注射牛瘟弱毒疫苗，6小时后就可在血液中发现较高浓度的IFN。接种后2 4小时即可抵抗强毒攻击。因为此时尚未产生抗体，所以可能就是IFN的作用。新城疫弱 毒疫苗常可在10～20多小时内使鸡产生对强毒感染的抵抗力，似乎出于同一原因 。牛在静脉注射传染性鼻气管炎病毒后，血清中的IFN在1～2天内达高峰，随后下降，但 在第7天仍能测出。但是目前尚无法确定动物体内哪种细胞、组织或器官负责大部分IFN的产生。在病毒血症 期间，淋巴细胞(尤其是T细胞)、NK细胞、K细胞以及巨噬细胞都会产生大量的IFNα、γ ，这些IFN成为血液中IFN的主要来源。人们普遍认为，IFN是动物机体在病毒感染后 康复的第一个机制。应用IFN预防小鼠的病毒感染，可以使其抵抗鼠痘和鼠肝炎病毒的 攻击；给豚鼠皮下或肌肉注射IFN，可使其抵抗狂犬病病毒的攻击。近年来利用体外诱导及重组的人和动物IFN对动物进行了广泛的实验室和临床试验。 人的重组IFNα可在Vero细胞上抑制猪瘟病毒的复制。重组猫IFN 在体外培养细胞上对猫的肠道致病病毒也有明显的抑制作用。给大鼠肌肉注射大鼠γ IFN可以保护大鼠免受致死性伪狂犬病病毒的感染。重组人IFN－αA 对以呼吸道合胞体病 毒 攻击的小牛也有一定的保护作用。重组人IFN－α2 对小牛的痘苗病毒感染具有明显的抗病 毒作用。连续2天给牛鼻内应用牛成纤维细胞IFN，然后用鼻病毒进行攻毒，发现应 用IFN的牛，只排少量病毒，但无一发生呼吸道 疾病症状，而对照牛则出现了明显的临床症状。此外，猪的重组IFN－γ对免疫抑制的猪具有免疫调节作用; 曾有报道， 利用牛IFN－γ能 够防 治牛围产期急性大肠杆菌性乳腺炎的发生。但是在动物试验中也发现了IFN的副作用 。 如连续给牛肌肉注射IFN 5天后，发现其直肠温度升高，循环淋巴细胞受到抑制，分 类计数表明 ，淋巴细胞和中性粒细胞数明显降低等。由于必须在病毒感染的早期，也就是体内病毒尚 未 广泛散布和引起严重病变之前应用IFN才能奏效，而且经常需要反复多次应用，又因IFN 具有明显的种属特异性，故对人与大动物来讲，就有一个如何制备足够量高效IFN的问题。 医学上主要应用离体培养的白细胞生产IFN，即由健康人的抗凝血分离血浆后 ，吸取红细胞表面上的白细胞层，用含4%人血清的Eagle营养液作成细胞悬液，加入小量IFN 预处理(可提高IFN产量)后，接种仙台病毒或新城疫病毒，37℃振荡培养16～20小时 后，离心沉淀，收获上清液，并加HCl使其pH下降至2.0，4℃冰箱放置1天(仙台病毒)或5天( 新城疫病毒)，使病毒灭活。随后再用NaOH将pH调回到7.0～7.4，再行离心沉淀，吸取上清, 即为粗制IFN。粗制IFN可进一步浓缩, 例如以聚乙二醇于4℃透析3～4天， 可得10倍浓缩液，或用电扇吹干后加入明胶冻干。也可应用硫氰酸钾盐析和酸性冷乙醇提取 等方法加以纯化。应用其它细胞培养系统，例如二倍体细胞株(成纤维细胞)和传代细胞系( 类淋巴母细胞)制造IFN的试验亦在进行中。王汝懿等(1991年)建立的人胚肌皮细胞株IFN β产量高达40.0×103 IU/ml。但其它二倍体细胞株的IFN产量较低。类淋巴母细 胞虽能进行大发酵罐的悬浮培养，也能产生高效价的IFN，但因是恶性变细胞的产品，人 们在安全性上存在疑虑，尚不敢普遍推广使用。应用其它肿瘤细胞，如Namalwa细胞制造IFN ，也有这方面的问题。80年代初期以来，IFN基因工程研究相继在世界各地开展，1980年Naga ta等通过细胞mRNA的反转录获得了IFNα的cDNA。与此同时，Meada等(1980年)和其它研究 者分别也 获得了人IFNβ的cDNA，Goeddel等(1982年)获得了IFNγ的cDNA。随后动物基因工程 IFN 的研究也相继展开，如Velan等(1985年)克隆并表达了牛的IFNα基因，Lefevre 等 (1986年)克隆了猪的IFNα基因。 Chalier(1989年)克隆并表达了羊的Ⅱ类IFNα， Sak ur aui等(1992年)利用重组杆状病毒在蚕体内表达了猫的IFN等，这些研究的结果普遍表明，重 组IFN 与天然IFN之间在结构及特性上具有很高的一致性。基因工程IFN的产生， 不 仅满足了人和动物剂量大的需求，而且由于大规模发酵生产，降低了成本。为IFN应用 于优良品种畜禽的病毒感染的防治提供了进一步的可能性。
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