3.研究方法 研究病毒的遗传变异，包括几方面的内容：从整体水平上研究病毒的突变率，即某病毒基因组一次复制过程中某一核苷酸位点因置换、缺失或插入而改变的可能性；根据某一遗传学指标(见上述)，从自然流行毒株中筛选或结合应用诱变因素筛选有意义的变异株；分析变异株突变的性质；通过人工突变研究某一位点(或区域)的改变对病毒遗传性状的影响。下面分别加以叙述。
(1) 病毒突变率研究：确定病毒突变率的方法有多种。首先，最直接的方法是体外测定病毒基因组复制酶的错配率，如水疱性口炎病毒(VSV)RNA聚合酶的错配率为10-3.15，但在体内聚合酶的错配率可能要更低一些；其次，病毒突变率可根据由一个纯化克隆衍生而来的病毒基因组群体中核苷酸置换的频率估计出来；或者由同一蚀斑衍生而来的大量病毒克隆的直接序列分析测定出来，后两种方法或许不能精确地反映病毒突变率，因为某些突变是致死性的，而且传代次数不易确定。除直接测定序列外，也可通过以下方法间接获得病毒的突变率：①从一个病毒克隆株中呈现特定表型的变异株出现的频率估计突变率。温度敏感性生长特性、蚀斑形态学、宿主范围以及致病性等表型受几种基因上不同突变的影响，显然不适于进行突变率的研究，不过，如果突变株及其回复突变株的突变性质清楚的话，某一表现型改变的变异株的回复突变频率可用于测定碱基置换率。Bos和Nayak(1986)测出一个流感病毒ts-变异株的突变率为10-3.5，Morita等(1987)报道了4个VSV ts-变异株的突变率分别为10-3.5、10-3.6、10-4.0和10-4.9；②测定野生型病毒克隆中抵抗病毒复制抑制剂的变异株出现的频率以估计病毒突变率。Pincus等(1986)测得脊髓灰质炎病毒胍抵抗性变异株出现的频率为10-7.4和10-6.7之间，该突变表型需要2个独立的突变，说明核苷酸置换率为10-3.7～10-3.4；③测定克隆中抵抗中和性单克隆抗体的变异株出现的频率，这是报道应用最多的方法。 不同病毒因不同方法测定的突变率各不相同。例如，用单克隆抗体测定的流感病毒RNA置换频率约为10-6，而根据ts-变异株回复突变以及直接序列分析相关的克隆RNA确定的结果为10-4；同样地，VSV中和作用抵抗变异株出现的频率比VSV ts- 变异株回复突变率(10-3.5～10-4.9)或直接序列分析VSV基因组RNA核苷酸置换获得的突变率(10-3.7)低10～100倍。相反，直接分析脊髓灰质炎病毒克隆测定的置换频率(〈10-5)比胍抵抗性变异株出现频率和中和作用抵抗性变异株出现频率低10～100倍。但无论怎样，应用同一种方法可以评价不同病毒的相对突变率。 有关DNA病毒突变率的资料较少，但似乎与RNA病毒相类似。单纯疱疹病毒(HSV)的中和作用抵抗性变异株的突变率为≥10-5，犬细小病毒的中和作用抵抗性变异株的突变率为10-3.4和10-5.4之间。
(2) 人工筛选变异株：在动物病毒变异研究中最具有实际意义的是获得毒力低，而仍保持免疫原性的弱毒株，也就是针对病毒致病性这一遗传学指标进行研究。动物病毒的许多毒力变异株是人工培育的结果，概括起来有以下几种减毒方法：[HT5K]异种动物适应性变异[HT5SS] 医学及兽医学上许多弱毒疫苗株就是利用通过自然条件下不感染或不易感染的所谓异种动物这个途径获得的。将强毒株转移到新宿主(一般常用实验动物)，开始时往往不引起或仅引起轻微的感染症状(或病变)。但是随着传代次数的增加，症状或病变逐渐增剧，甚至引起典型的发病、死亡。而此时往往减低了对其原宿主的毒力。例如猪瘟兔化弱毒株，就是多代通过兔体，在增高对兔体毒力的同时减低了其对原宿主(猪)毒力的猪瘟病毒株。同样，兔化牛瘟毒株、鼠化和兔化口蹄疫毒株、鼠化马瘟毒株等也都是适应于异种动物的典型例子。[HT5K]异常感染途径适应性变异[HT5SS] 将病毒通过非正常感染途径接种，也可达到使毒力致弱的目的。朱既明等在将森林脑炎病毒株对乳鼠进行连续的脑内接种传代后，在腹腔或皮下注射时的毒力逐步降低，传代40次后，皮下注射基本上不能致病。黄热病病毒也有这样的例子，泛嗜性黄热病病毒经小鼠脑内连续接种传代后变为嗜神经性，泛嗜性消失，非脑内接种时不再呈现病原性。[HT5K]鸡胚适应性变异[HT5SS] 30年代发展起来的鸡胚培养技术，对病毒培养和弱毒疫苗株的培育起了巨大的推动作用，至今它仍然是病毒学研究的常规技术之一。鸡胚化牛瘟病毒株、鸡胚化乙型脑炎毒株、鸡胚化狂犬病毒株等都曾成功地用作疫苗毒株。[HT5K]细胞适应性变异 [HT5SS]40年代发展起来的组织细胞培养技术成为病毒研究中的重要方法，也是目前应用于弱毒株筛选中的主要手段。例如乙型脑炎病毒经仓鼠肾细胞、鸡胚成纤维细胞传代后，对人及家畜的毒力明显下降；麻疹病毒经鸡胚成纤维细胞传代后对人的毒力下降等；犬肝炎病毒通过猪肾细胞培养，牛瘟病毒通过绿猴肾细胞培养，也都获得了弱毒株。应用同种动物细胞，例如将猪瘟病毒和牛腹泻—粘膜病病毒分别在猪白细胞培养物和牛肾细胞中传代，也获得了弱毒株。但因敏感细胞缺乏选择性，病毒粒子不纯。故以敏感细胞培育的弱毒株，应再以蚀斑法或终点稀释法进一步纯化。 必须指出的是，某些病毒的感染范围很窄，即使应用上述多代“强迫”接种方法，仍难适应在异种动物或细胞中增殖，当然无法应用这一手段达到减毒目的。[HT5K]ts-变异株和低温适应株的培育 [HT5SS]由于ts-变异株和低温适应株的毒力一般都较原毒株低。因此，应用诱变剂选育ts-变异株以及应用低温培养方法培育低温适应株，已是实验室内取得弱毒株的一个重要手段。这类变异株常可通过诱变剂处理同时进行适当选育的方法获得。在已经接种病毒的细胞培养物中加入亚硝酸、盐酸羟胺或5溴脱氧尿核苷和2氨基嘌呤作诱变剂，虽然绝大多数病毒此时已经灭活，但仍可能残存少数病毒保持活力，这些病毒在上述诱变剂的作用下发生突变经过一定程度的增殖之后，即有可能从中选育出ts-突变株。例如Sambrook等(1966)应用5溴脱氧尿核苷和2氨基嘌呤作诱变剂，加入已经接种兔痘病毒的鸡胚成纤维细胞的维持液中，再经蚀斑选育，获得只能在34.5℃(称为允许温度)而不能在39.5℃(称为非允许温度或限制温度)增殖的突变株；Williams(1971年应用亚硝酸、羟胺和5溴脱氧尿核苷等作诱变剂，育成了40个腺病毒ts-突变株，可在31℃生长，但不能在38℃增殖；Pringle(1971)在培养液内加入5氟尿嘧啶，随后作蚀斑分离，由881个VSV克隆株中选育出9个稳定的ts-变异株，这些ts-变异株可在31℃增殖，但不能在40℃增殖。 目前已在流感病毒、口蹄疫病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、脑炎病毒和多型瘤病毒等多种病毒中，通过类似方法获得了ts-变异株。[HT5K]重组试验 [HT5SS]不仅是研究病毒遗传学，特别是了解病毒基因的排列组合及
其与表现性状之间的关系等的一个重要手段，也是培育或创造新毒株的一个有效途径。 实验室内的重组试验常在培养细胞或鸡胚中进行。亲本株必须尽可能纯化，而且两个亲本株之间至少需要具有两个以上的性状差别。将两个亲本株混合感染培养细胞或鸡胚以后，收获子代病毒，并作纯系分离，选育其中具备两个亲本株“杂交”性状的新毒株，即为重组型。例如一个重组型流感病毒可以具有来源自一个亲代病毒株的血凝素和另一个亲代病毒株的神经氨酸酶。Tumova等(1965)应用活的甲2型流感病毒和紫外线灭活的鸡瘟病毒混合感染鸡胚组织培养细胞，获得一株具有鸡瘟病毒蚀斑形成能力和甲2型流感病毒不耐热血凝素特性的重组型病毒，此株病毒同时含有上述两种病毒的株特异性抗原。熊光明用口蹄疫病毒(FMDV)和猪肠道病毒(EV)混合感染IBRS2细胞，经过适当的筛选、克隆，鉴定了一个具有FMDV和EV抗原特性的重组病毒株。
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