组织培养中的污染与防治

  1、真菌的污染

    真菌(fungi) 一类没有叶绿素，异养的真核微生物。除极少数种类是单细胞外，绝大多数是由多细胞组成的菌丝，结成一团的菌丝称菌丝体，菌丝分有隔菌丝和无隔菌丝两种。有隔菌丝是由多个细胞组成，相邻的细胞之间由隔丝隔开。在地球上广泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內。皆可有真菌生长。大气中已知的真菌有11255属10万种，在室内常附着在物体表面，能自动或随人的活动而扩散。种类丰富，分布广泛，繁殖快速，无处没有，无处不在。一个季节繁殖4-5代，孢子可达1万亿个

    室内真菌种类：主要有芽枝孢霉属、曲霉属、铰链孢霉属、镰刀霉属、青霉属等，真菌数量的多少，与温度、湿度有很大关系。真菌以腐生、寄生或共生的型式進行異營性生活。釋放消化酵素於鄰近的環境，以分解食物成較小的水溶性分子進入細胞內消化。並可於菌絲產生孢子以完成有性或無性繁殖。

    真菌季节变化：春、夏季．尤其是南方的梅雨时节．温暖潮湿，非常适合真菌生长。冬季室内真菌浓度较高。

    空调加重污染：如果长期使用空调而不注意通风，可引起室内真菌污染。室内有空调比没有空调情况下曲雾菌落数多4倍。

    2、细菌（bacteria）的污染

    细菌是一类微小的单细胞生物，约有２０００多种。从形态上看，细菌可以分成球菌、杆菌和螺旋菌３类。细菌是无孔不入的微生物，儿童玩具、手机、计算机键盘和衣服上，甚至植入人体的医用植入物等（如心脏起搏器），都随时有可能沾染细菌，对人体造成危害。为避免细菌的侵袭，科学家曾尝试用抗微生物材料生产各种用品，但效果不十分理想，因为这些材料虽然能杀死细菌，却充满化学物质。细菌是处于生物和无生物之间的东西。泥土里、水里、都市的空气里都有细菌散布着，多到50种以上。

    三类细菌的形状：就是球形的，杆形的，及螺旋的。球形的有的正圆，有的卵圆；杆形的有长有短，有的微弯螺旋形的也有长短和弯曲的转数多少的不同，有的生着细毛，毛长与短多少不定。虽然概括地说，形状只有球形、杆形、螺旋形这几种，但细分起来，形状还是很不少。论大小，它长约1～2微米，阔0.5微米余。病菌，能分泌出毒质，如果寄生在体里，因病菌种类的不同，人就会发生不同的疾病。

    3、组织培养过程中的污染源

    [1]户外风大菌类进屋机会多

    [2]屋内太潮菌类繁衍多

    [3]物品带菌多

    [4]屋内不干净

    [5]屋内清理带菌组培苗

    [6]接种不正确

    4、菌类传播途径

    [1]户外风传播

    细小如尘 随风飘散 由上下落 见湿就长 有风就有沙 有沙就有尘 有尘就有菌 菌尘混共存

    [2]涡流传播

    我们在大街上常常看到一些大货车驶过后，马路上的尘土、纸屑打着转满天飞，这就是汽车行驶搅动空气形成的涡流。汽车的前挡风玻璃、车顶、车侧、车后都可以产生涡流。涡流在自然界可说是无所不在，在这些涡流中人们若是想要观察涡流旋转方向改变的话就必须将整个涡流给破坏掉。超净工作台上，摆放物品太多，当无菌风吹过时，就会在物品周围形成涡流群，菌类就会在涡流群中停留，从而降低净化效果，增加污染机会。

    [3]接种传播脏手每只带有细菌4万~40万，干净的手，指甲盖大小也有3200多个细菌。指甲缝可以窝藏30多种细菌。1克重的指甲垢里竟藏有38亿个细菌。洗的手3小时后，在大拇指的细菌由原来的300个变成30万个。如果手上带菌较多，在操作过程中，就难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。用肥皂洗手比不用肥皂洗手的杀菌功效要大8~10倍。流动的温水可去掉95%以上。因此，在注意个人卫生的同时，操作前一定要对手进行彻底消毒。

    另外，不正确操作也会增加污染机率掀盖生硬，灭菌不够，操作过慢等。接种过程应该轻开盖，火灭慢，操作快。

    5、相应的措施

    通风：经常开窗，保持室内空气流通．可以使室内真菌数量减少。通风方法简便易行．应多使用。

    去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。

    光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。因此，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处。

    防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。

    6、污染原因判断及污染苗抢救

    [1]若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多。

    若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染；

    若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌；

    [2]真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。

    [3]用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响植物材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用。

    [4]本研究室自1999以来，在污染防治研究和简化组培的基础上有了突破性进展，通过对国内外近百种抑菌材料的选择、配比，成功研制出了广谱性杀菌药剂—山农1号。该药剂在低浓度下，就能抑制各类真菌和细菌的生长繁殖，在不经高压灭菌和超净工作台接种的情况下，在40天内，污染率也能控制在5%以下，在2003-2004年，本试验室进行了大规模的污染防治和开放接种试验，试验表明，利用山农1号进行彻底简化组培环节，降低组培生产，使组织培养走出试验室，进入千家万户，是完全可能的。本研究有望在2005年，进行鉴定和推广应用。

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