TGF2/Smads通路在肝癌的发病机制中占重要作用,核中磷酸化的Smad2P2Smad2的聚集可能对肝癌的发生发展有重要意义,Lin等人在研究乳腺癌中发现PPM1A磷酸酶可通过使核中磷酸化的Smad2的C末端SXSS去磷酸化来调节TGF2/Smads通路,从而也使大家对探索肝癌的发生机制及寻找新的有效治疗靶点有了新的希望,PPM1A蛋白磷酸酶的有关研究成为焦点,但因其抗体的不足,限制了研究进展。在这里,我们利用PPM1A蛋白磷酸酶全长原核表达质粒制备特异性的鼠多克隆抗体,为研究PPM1A在肝癌或其他疾病中的生物学特性.
1.1　主要材料　异丙基22D硫代半乳糖苷IPTGNi2NTASpinColumn试剂盒抗组氨酸His6标签鼠单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠IgG工作浓度分别为1∶1000和1∶5000;PPM1A鼠单克隆抗体工作浓度为1∶100;FITC标记的羊抗鼠IgG为Picerce公司产品,工作浓度1∶100;DMEM培养基干粉胎牛血清购自杭州四季青公司;氢氧化铝佐剂pBEX12PPM1A2His原核表达质粒,高效表达菌BL21(DE3)plysS及HepG2细胞均由本室保存;5～7周龄雌性Balb/c小鼠,
1.2　重组质粒的原核表达　将含有pBEXPPM1A2His重组质粒的BL21DE3plysS菌接种于5mLSOB液体培养基含100mg/L氨苄青霉素和35mg/L氯霉素,37℃振荡培养12h后,按1∶100比例接种到200mLSOB液体培养基中,37℃振荡培养4～6hA600nm=0.4～0.6时,加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L,37℃,250r/min诱导4h,同时空载体进行同样的转化和诱导作为对照。
1.3　目的蛋白纯化和复性　用Ni2NTA法纯化蛋白,先将菌体沉淀按5mL/g的湿重混悬于预冷的裂解缓冲液中,反复冻融3次,然后超声破菌,溶解物4℃,10000g离心20min,弃上清液,沉淀经包涵体纯化步骤后,沉淀溶于6mL尿素,按Qiagen公司的Ni2NTASpinColumn试剂盒说明书进行目的蛋白的纯化,并用SDS2PAGE电泳观察纯化效果。将纯化所得蛋白用冷PBS透析复性。
1.4　目的蛋白的浓度及纯度检测　目的蛋白BL21DE3进行SDS2PAGE电泳后,进行蛋白条带灰度扫描,用Gelwork1DadvancedV4.01软件进行纯度分析。并用标准的Bradford检测法测定目的蛋白的浓度。
1.5　目的蛋白Westernblot鉴定　按Westernblot操作步骤进行。空菌及重组质粒转化菌变性后经SDS2PAGE分离,半干法转印蛋白到硝酸纤维素膜上,用100mL/L的FCS/PBST4℃封闭过夜,加入第一抗体鼠抗His抗体/鼠抗PPM1A单克隆抗体,37℃震荡孵育1h,PBST漂洗3次,加入稀释的第二抗体HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃震荡孵育1h,PBST漂洗3次,加入ECL孵育,压片曝光。
1.6　动物免疫　将Ni2NTA纯化回收并复性的目的蛋白350g溶于500L生理盐水中,再与等体积的氢氧化铝佐剂混合,按35μgII只的抗原剂量分别免疫9只Balb/c小鼠,背部皮内多点注射。第14天和第28天各加强免疫1次,加强免疫的方法和抗原剂量同上。第35天摘小鼠眼球取血,静置离心后分离血清,4℃保存。
1.7　抗体滴度检测　参照文献[3]的ELISA法检测抗体效价。即用Ni2NTA法纯化所得的PPM1A2His融合蛋白目的抗原按10g/mL、1g/mL和0.1g/mL的梯度,包被ELISA板100L/孔,4℃孵育过夜,用新配制的PBST洗液洗5次,50g/LBSA每孔200μL封闭后,加入用10mL/LFBS/PBS稀释的不同梯度的免疫小鼠血清抗体按1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000),37℃孵育1h,PBST洗5次,加1∶5000稀释的酶标二抗HRP标记的羊抗鼠IgG,37℃孵育60min,PBST洗5次,以四甲基联苯胺TMB2过氧化氢系统为底物37℃显色5min后,终止,酶标仪450nm波长检测各孔吸光度值。同时以正常鼠血清为阴性对照及PBS为一抗空白。
1.8　多克隆抗体特异性检测　①免疫组织化学检测:利用PPM1A多克隆抗体1∶800稀释检测人肝癌组织PPM1A的表达,按DAKOEnvision法试剂盒说明书操作,DAB法显色,以正常小鼠血清和PBS分别作为阴性对照和空白对照。②免疫荧光检测:24孔板中用含100mL/L新生牛血清的DMEM培养基常规培养的HepG2细胞贴壁生长至80%～90%融合,用PBS洗3次,用冷500mL/L甲醇固定15min,1mL/LTritonX2100室温处理10min,100mL/L正常羊血清室温封闭20min,加入PPM1A多克隆抗体血清1∶50,对照组加入同样稀释的未经免疫的小鼠血清,4℃孵育过夜,PBS洗3次,加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗1∶100,37℃,避光孵育30min,PBS洗3次后用荧光显微镜观察并记录。
   
   

 

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