PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,它通过发挥磷酸酶作用,降低多种信号传导途径的关键酶的磷酸化水平,阻断信号传导通路,以抑制细胞的生长、黏附、铺展和迁移,诱导凋亡,从而对肿瘤的生长、侵袭和转移产生负性调节作用。PI3K2Akt途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要的信号转导通路,细胞外信号分子通过磷酸化依次激活三磷酸酰肌醇激酶PI3K、蛋白激酶BAkt/PKB及其他下游信号分子,以促进细胞的增殖,抑制凋亡并对细胞周期起正调控作用,导致细胞恶性转化。本实验检测PTEN基因转染前后膀胱癌细胞P110(PI3K的催化亚单位、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt的表达情况,以期证明PTEN可能通过PI3K2Akt信号传导途径起抑癌作用。
1、材料与方法
1.1主要材料和试剂　人膀胱癌细胞,pBp2PTEN及pBabe2puro(pBp)空质粒,DH5α大肠杆菌菌株。Trizol和大量质粒抽提纯化试剂盒、限制性内切酶EcoRⅠ、脂质体Lipofectamine2000、PCR引物、通用RT2PCR试剂盒
1.2细菌的转化和扩增培养　氯化钙法制备感受态大肠杆菌DH5。于EP管中加入质粒和感受态DH5混匀后至水浴中热休克,再加入无抗生素LB培养基孵育。从EP管中取菌液,接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上,培养过夜。挑取单个菌落,转入含氨苄青霉素的LB培养基中,振摇过夜至饱和生长,-70℃冰箱保存。
1.3质粒的抽提纯化和酶切鉴定　取质粒转化的菌液到含氨苄青霉素的LB培养基中,振摇过夜。按大量质粒抽提纯化试剂盒说明书的步骤,提取并纯化pBp2PTEN或pBp。将纯化的质粒DNA,于紫外分光光度计上检测纯度,A260/A280=1.8—2符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切DNA片段。
1.4基因转染和细胞筛选　在6孔板中接种BIU287细胞,培养至满70%-80%,按脂质体Lipo2fectamine2000说明书的步骤,将pBp2PTEN或空质粒pBp导入BIU287细胞,转染24h后换液,并于荧光显微镜下观察,继续培养48h,加嘌呤霉素筛选并扩增培养。
1.5RT2PCR提取细胞RNA后,按通用RT2PCR试剂盒步骤进行操作。反应条件:94℃预变性5min,94℃变性50s,58℃退火50s,72℃延伸1min,循环32周,72℃再延伸8min。将pBp2PTEN转染细胞pBp2PTEN2BIU87、pBp转染细胞pBp2BIU87和未转染细胞(BIU287)的PCR产物分别经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,凝胶分析系统观察。
1.6Westernblot制作凝胶SDS2聚丙烯酰胺凝胶后,凝胶板安置于电泳槽,将处理好的样品加入槽内。电泳后取出凝胶,进行半干式电转移,胶中的蛋白质将转移至膜上。最后行免疫显色。膜置滤纸上干燥,分析结果。质粒鉴定证实含有PTEN基因,RT2PCR证实PTEN转染后稳定表达。三种细胞P110和Akt的Westernblot阳性条带强度相似,提示转染前后P110和Akt蛋白的总水平无明显变化;PTEN转染后,磷酸化P110和磷酸化Akt的阳性条带明显较对照组弱,说明PTEN转染导致P110和Akt的磷酸化水平降低   
   

 

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