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    食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验4——GB



    录入时间:2009-1-12 15:50:16 来源:青岛银河澳门官网入口

    A.3检验程序
    A.3.1从菌株中检测肠毒素从菌株中检测肠毒素程序见图A.1(略)。
    A.3.2从食物检样中提取和检测肠毒素
    A.3.2.1微玻片法检测肠毒素(浓缩法和层析法)程序见图A.2(略)。
    A.3.2.2酶联免疫法检测肠毒素程序见图A.3(略)。
    A.4肠毒素检测
    A.4.1从菌株中提取肠毒素方法
    A.4.1.1液体透析培养法:用宽2.5cm、长80cm的透析袋装入60mL产毒培养基,两端扎紧,将透析袋装入250ml锥形瓶内,加人15mL灭菌生理盐水,透析袋两端留在瓶口,用棉塞塞好,121℃高压灭菌30min,待测菌株接种曹养琼脂斜面(试管18mm*180mm),37℃培养24h,用5mL生理盐水洗下菌落,倾人上述培养瓶中,每个菌种种一瓶,37℃振荡培养48h,振速为100次/min,吸出菌液离心,8000r/min3Omin,取上清液做双相琼脂扩散,如为阴性,再装入透析袋内,用电风扇吹,或用多聚乙二醇,浓缩至1mL-2mL,再做琼脂扩散。A.4.1.2固体透析培养法:向直径150mm的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾人灭菌产毒培养基约100mL——120ml,凝固后表面铺一灭菌玻璃纸,待测菌株接种在营养琼脂上,37℃培养24h,用约3mL灭菌盐水洗下菌苔,倾在玻璃纸上,用灭菌三角棒涂满平皿,37℃培养48h,加人10mL——20mL灭菌生理盐水,用灭菌三角棒刮取菌苔,吸取菌液离心,以下步骤同液休透析培养法。
    A.4.2从食品中提取肠毒素方法
    A.4.2.1直接浓缩法:取食品样品100g,加入无菌0.2mol/L pHI7.5磷酸盐缓冲液,均质成匀浆,置4℃浸泡18h——24h,用纱布过滤将滤液离心8000r/min 20min.取上清液,放入分液漏斗中,加人10ml三氯甲烷,振摇10min,静置,将底层三氯甲烷弃去(如不分层,可8ooor/min离心20min)。加人6mol/l盐酸溶液调pH至4.5,8O00r/min离心20min,取上清液,加5mol/L氢氧化钠溶液,调pH至7.5,离心取上清液,装入透析袋或玻璃纸,用电扇吹干,或放多聚乙二醇浓缩至1mL——2mL,做微玻片双向琼脂扩散。
    A.4.2.2层析法:如需提取较纯肠毒素,可将上述浓缩液用蒸馏水洗下,装入透析袋,以0.008mol/L pH5.6磷酸盐缓冲液平衡,加人CM层析柱内,流速lmL/min——2mL/min,用0.008mol/LpH5.6磷酸盐缓冲液洗脱,再用0.2mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱出肠毒素。洗脱液装人透析袋内,用电扇或多聚乙二醇浓缩至1mL,做微玻片双向琼脂扩散,检测肠毒素。
    A.4.3双向琼脂扩散检测肠毒素
    A.4.3.1微玻片法:将在95%乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦千,吸取溶化的0.2%琼脂糖(蒸馏水配制)滴在载玻片上,使剩余的琼脂糖流下,放在无尘的环境中干燥,先将一层薄塑料板放在载玻片上,然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林,放在塑料板上,两边用橡皮圈系紧固定,吸取1%琼脂糖,立即从模板中间孔加人载玻片和模板之间,直至充满琼脂糖,凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去,在中间孔滴加抗血清,四周滴加菌株产毒液或食品提取液,放人加有湿棉球的容器内,放25℃一30℃、18h——24h观察结果。可在灯光上,并对着暗的背景观察,在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时,可进行染色。
    A.4.3.2玻片法:吸取溶化的1%琼脂糖2.5mL,铺在洁净载玻片上.凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成幅射型,孔距为2.5mm,中心孔加人肠毒素抗血清,周围六个孔加人菌株或食品的肠毒素提取液,放入有滴加2/10000三氮化钠湿棉球的容器内,以保持湿度。置25℃~30℃、18h-20h,观察结果,在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。
    A.4.3.3染色法;用微玻片法取下胶带和有机玻璃摸板,玻片法可直接将玻片放人蒸馏水中浸泡4h-5h,中间换2次~3次水,在下述各液中浸10min,10%乙酸中含1%唾嚓红R(或氨基黑);1%乙酸;1%乙酸含l%甘油,如脱色不净,可继续浸泡。取出后盖一滤纸,吸去多余液体,在室温或35℃烘干。阳性者沉淀被染上颜色,可长期保存.
    A.4.4酶联免疫法检测肠毒素(双抗体法)
    A.4.4.1包被抗体:用0.1m1/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5ug/mL,加人洗净的苯乙烯凹孔板内,每孔0.2mL,置36℃士1℃30min,弃去上液。
    A.4.4.2洗涤:用0.05% 0.02mol/L pH7.2吐温-20缓冲液洗涤五次。
    A.4.4.3加人检样:如为液体,可直接加人0.2mL,固体样品取100g,加人0.2mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液100ml,均质后取过滤液0.2mL。A.4.4.4洗涤:同A.4.4.2。
    A.4.4.5每孔内加人酶抗体0.2ml,置36℃士1℃30min,同时做阳性和阴性对照。弃去上液。
    A.4.4.6洗涤:同A.4.4.2.
    A.4.4.7每孔内加人邻苯二胺酶底物溶液0.2mL,室温放置加而饥A.4.4.5每孔内加人2mol/L硫酸0.05mL,立即放酶标仪比色。
    A.4.4.9结果判定:样品OD值比阴性对照,比值大于2为阳性,小于2为阴性。   
       

     

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