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实验二 普通光学显微镜 1



录入时间:2009-1-5 9:48:36 来源:青岛银河澳门官网入口

一、显微镜的基本构造
  显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。
1.机械装置
  镜座(base)和镜臂(arm)镜座位于显微镜底部,呈马蹄形,它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种,活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。
  镜筒(body tube)是由金属制成的圆筒,上接目镜,下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种,单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的,倾斜式镜筒倾斜45°。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置,以备在两眼视力不同的情况下调节使用。
  转换器(no sepiece)为两个金属碟所合成的一个转盘,其上装3—4个物镜,可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。
  载物台(stage)又称镜台,为方形或圆形的盘,用以载放被检物体,中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹,用以固定标本;有的装有标本推动器,将标本固定后,能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度,能确定标本的位置,便于找到变换的视野。
  调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件,有粗动螺旋(coarse adjustment)即粗调节器和微动螺旋(fine adjustment)即细调节器,利用它们使镜筒或镜台上下移动,当物体在物镜和目镜焦点上时,则得到清晰的图像。
2.光学系统
  物镜(objective)物镜安装在镜筒下端的转换器上,因接近被观察的物体,故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大,是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如:NA0.30;10×;160/0.17;16mm。其中“NA0.30”表示数值孔径(numerical aperture,简写为NA),“10×”表示放大倍数,“160/0.17”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度(mm),16mm表示焦距。
  目镜(ocular lens)装于镜筒上端,由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像再次放大,不增加分辨力,上面一般标有7×、10×、15×等放大倍数,可根据需要选用。一般可按与物镜放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500—700倍,最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大,反而影响观察效果。
  聚光器(condenser)光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本,增强照明度和造成适宜的光锥角度,提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈(iris diaphragm)组成,聚光镜由透镜组成,其数值孔径可大于1,当使用大于1的聚光镜时,需在聚光镜和载玻片之间加香柏油,否则只能达到1.0。虹彩光圈由簿金属片组成,中心形成圆孔,推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小,可得到适当的光照和清晰的图像。
  光源(light source)较新式的显微镜其光源通常是安装在显微镜的镜座内,通过按钮开关来控制;老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜,反光镜是一个两面镜子,一面是平面,另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时,用平面反光镜;使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。
  滤光片(filter)可见光是各种颜色的光组成的,不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时,就要用滤光片。选用适当的滤光片,可以提高分辨力,增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的,分别透过不同波长的可见光,可根据标本本身的颜色,在聚光器下加相应的滤光片。
3.成像原理
  普通光学显微镜的成像原理如图Ⅲ-2所示。
二、油镜物镜的基本原理
  微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜(16mm,10×)、高倍物镜(4mm,40—45×)和油镜(1.8 mm,95—100×)三种。油镜通常标有黑圈或红圈,也有的以“OI(oil immer-sion)字样表示,它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜,可使被检物体放大1000—2 000多倍。从图Ⅲ-3中可看出油镜的焦距和工作距离(标本在焦点上看得最清晰时,物镜与样品之间的距离)最短,光圈则开得最大,因此,在使用油镜观察时,镜头离标本十分近,需特别小心。
  使用时,油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气,而是隔一层油质,称为油浸系。这种油常选用香柏油,因香柏油的折射率n=1.52,与玻璃相同。当光线通过载玻片后,可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气,则称为干燥系,当光线通过玻片后,受到折射发生散射现象,进入物镜的光线显然减少,这样就减低了视野的照明度(图Ⅲ-4)。
  利用油镜不但能增加照明度,更主要的是能增加数值孔径,因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径,即光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦,乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积,可用下列公式表示:
NA=n·sinα 式中NA=数值孔径;n=介质折射率;α=最大入射角的半数,即镜口角的半数 
  因此,光线投射到物镜的角度愈大,显微镜的效能就愈大(图Ⅲ-5),该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时,α的理论限度为90°,sin90°=1,故以空气为介质时(n=1),数值孔径不能超过1,如以香柏油为介质时,则n增大,其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°,其半数的正弦为sin60°=0.87,则:
  以空气为介质时:NA=1×0.87=0.87
  以水为介质时:NA=1.33×0.87=1.15
  以香柏油为介质时:NA=1.52×0.87=1.32
  显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比,与光波长度成反比。因此,物镜的数值孔径愈大,光波波长越短,则显微镜的分辨力愈大,被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此,一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离,这两个因素是成反比关系的,通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米,这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。式中λ=光波波长。
  我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm,假如数值孔径为0.65的高倍物镜,它能辨别两点之间的距离为0.42μm。而在0.42μm以下的两点之间的距离就分辨不出,即使用倍数更大的目镜,使显微镜的总放大率增加,也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜,增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时,能辨别两点之间。因此,我们可以看出,假如采用放大率为40倍的高倍物镜(NA=0.65),和放大率为24倍的目镜,虽然总放大率为960倍,但其分辨的最小距离只有0.42μm。假如采用放大率为90倍的油镜(NA=1.25),和放大率为9倍的目镜,虽然总的放大率为810倍,但却能分辨出0.22μm间的距离。
三、器材
  显微镜,显微镜灯,香柏油,二甲苯;
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)染色玻片标本,
  枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)染色玻片标本。   
   

 

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