5 样品处理
5.1 鬃、毛、绒、生骨粒
5.1.1 根据样品多少将适当数量的同批样品(最多不超过 10份)合编为一个检验样品单位,作好记录。
5.1.2 从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取 1～2g样品,一起放入一个适当大小的灭菌三角烧瓶中。
5.1.3 加样品量 30～40倍(W/V)的预冷洗样液于三角烧瓶,用灭菌胶塞将瓶口塞严。
5.1.4 将三角烧瓶放入冰水浴或 0～4℃冰箱内,间或摇动约 1h。
5.1.5 将瓶中洗样液倒入 500mL灭菌离心管内,盖住管口,以3000r/min离心20min。
5.1.6 弃去上清液(注意防止污染),加少许灭菌水,使沉淀均匀悬浮。
5.1.7 将离心管静置 5～10min,待杂质下沉后,将上悬液移入另一支灭菌试管内,于65℃恒温水浴加热 30 min。
5.1.8 加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验,应贮于0～4℃冰箱内,以防芽胞发芽。
5.2 动物毛皮如不立即检验,将棉拭子放于0～4℃冰箱内。
6 检验方法
6.1 分离培养
6.1.1 鬃、毛、绒、生骨粒
6.1.1.1 根据每管所包括样品份数之多少,各接种 1～3个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接种时,用灭菌吸管吸取样液,滴加于平板表面,各0.1～0.3mL。如有剩余样品,可增接数个平板,直至将样品接种完。
6.1.1.2 用灭菌 L形玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多,可将平板置于36±1℃温箱,微开皿盖,使样液迅速干燥。
6.1.1.3 翻转平皿,置于36±1℃恒温箱,培养 24～48h。
6.1.2 动物毛皮
6.1.2.1 将棉拭子由试管内取出,各涂抹一个溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。6.1.2.2 翻转平皿,置于36± 1℃恒温箱,培养 24～48 h。
6.2 菌落及菌形观察
6.2.1 将培养的平板取出,用肉眼,必要时借助放大镜观察有无典型炭疽杆菌菌落。炭疽杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、无光泽、表面粗糙、边缘不整齐。用放大镜观察,边缘呈卷发状,用接种针探触,有粘滞感,挑之,可拉起丝。
6.2.2 从典型或可疑菌落取培养物制备涂膜,经革兰氏染色,镜检。炭疽杆菌被染成蓝紫色,由多个菌纵连成长链。少数单个菌呈大杆状,两端平齐。有的菌体中央可见卵圆形不着色的芽胞。芽胞不使菌体膨大。
6.3 肉汤培养特性观察取菌落和菌形均似炭疽杆菌的培养物,接种肉汤管,于 36±1℃恒温箱培养 5～12h,观察细菌生长情况。炭疽杆菌在肉汤中生长初期的特征是：肉汤上部澄清,无菌膜,下部有絮状沉淀,沉淀不易摇散。
6.4 确定试验
6.4.1 大豆凝集素吸收试验
6.4.1.1 方法
a. 加大豆凝集素稀释液(A11)一滴于比色板或载玻片上。
b. 用接种环取一满环可疑菌落,研混于大豆凝集素稀释液内成浓厚菌液,持续搅拌2～3min。
c. 加一滴 5％兔血球悬液,搅匀,前后倾动玻片 3～5min,观察血球是否凝集。
6.4.1.2 判定
＋＋＋＋：血球凝集成块状,均匀散布,液体无色。
＋＋＋：血球凝集成大颗粒,均匀散布,液体无色。
＋＋：血球凝集成颗粒,均匀散布,液体无色。
＋：血球凝集成细小颗粒,均匀散布,液体无色。
±：血球凝集成细微颗粒,均匀散布,液体呈不显著黄红色。
－：血球不凝集,摇动后汇集于中央,呈淡黄红色,液体呈不显著黄红色。
注：“＋＋＋”～“＋”为阳性。“±”为可疑。“－”为阴性。
6.4.2 噬菌体裂解试验
6.4.2.1 方法
a. 用营养琼脂平板的皿底外面画三个直径约 30mm ,相隔约 20mm为圆圈。
b. 用接种环取可疑炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物涂满与两个圆圈相对应的琼脂表面。另取已知炭疽杆菌的新鲜肉汤培养物,涂满与第三个圆圈相对应的琼脂表面,作上区分的标记。
c. 待菌液被吸干后,在接种被检菌的圆圈内,一个加一滴无菌肉汤,另一个加一滴炭疽杆菌噬菌体。在接种已知炭疽杆菌的圆圈内,加一滴炭疽杆菌噬菌体。
d. 将平皿放入36±1℃ 恒温箱(隔架面要平,以防噬菌体液流散),微开皿盖,使液体迅速干燥。然后翻转平皿,培养12～18h。
6.4.2.2 判定
a. 加噬菌体的两个圆圈内都出现蚀斑,加肉汤的圆圈内无蚀斑,为阳性反应。
b. 加已知炭疽杆菌的圆圈内出现蚀斑,加被检菌的两个圆圈内无蚀斑,为阴性反应。
c. 三个圆圈内都无蚀斑,表明噬菌体已失效,应另换有效噬菌体进行试验。
6.4.3 串珠试验
6.4.3.1 方法
a. 取适量 4～12h可疑炭疽杆菌肉汤培养物,接种于 1.8mL肉汤管内(制备湿片在低倍显微镜下检查,每个视野应含菌链 5～10条)。
b. 加 5IU/mL青霉素 0.2mL,使青霉素最终浓度为 0.5IU/mL 。
C. 于 37℃水浴培养 1～2h ,取出,加入 20％ 福尔马林 0.25 mL,固定 10 min。
d. 制备湿片,在显微镜下检查。
6.4.3. 判定
＋＋＋＋：菌体大而圆,均匀,排列整齐；
＋＋＋：菌体圆,均匀,排列整齐；
＋＋：菌体椭圆,排列整齐；
＋：菌体均匀肿大,变粗；
±：菌体大小不一,不圆,排列不整齐；
－：菌体形态无变化。
注：“＋＋＋＋”～“＋”为阳性。“±”为可疑。“－”为阴性。6.4.4 动物试验6.4.4.1 取可疑炭疽杆菌的肉汤培养物,用生理盐水稀释为 10 000个菌/mL(微混浊),接种 2～3只小白鼠。一只于皮下注射 0.1mL；其余每只于腹腔注射 0.2mL。
6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常于1～3d内),立即进行剖检,观察有无炭疽病理变化(如皮下胶样水肿,脾脏肿大,血凝不良),制备数张血液和腹水涂片,供做菌形检查,同时取病变材料或体液接种数管肉汤,以备核查。
6.4.5 染色镜检
6.4.5.1 染色液的配制
A液：美蓝 0.3g乙醇(95％) 30.0mL
B液：0.01％氢氧化钾溶液 100mL将 A、B两液混合而成。
6.4.5.2 染色方法
a. 将被检材料的涂片浸入固定液内 15～20 min；
b. 滴加染色液浸没涂膜,染色 1～2 min；
c. 用水冲去染色液,自然干燥或用吸墨纸吸干水分；
d. 镜检。
6.4.5.3 判定炭疽菌菌体呈蓝色,粗大杆状,两端平齐,相连成短链或成对,菌体周围以淡蓝紫色荚膜。
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