【GB/T 16347—1996】 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验
1 主题内容与适用范围
本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。
本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。
2 引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂
3 术语
乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。
4 设备和材料
4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒温水浴：46±1℃。
4.4 电炉：可调式。
4.5 吸管：容量为1，10和25mL。
4.6 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。
4.7 平皿：直径为9cm。
4.8 试管：18×180mm。
4.9 显微镜。
5 培养基和试剂
5.1 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)。
5.2 改良MC培养基(Modified Chalmers培养基)。
5.3 0.1%美兰牛乳培养基。
5.4 6.5%氯化钠肉汤。
5.5 pH9.6葡萄糖肉汤。
5.6 40%胆汁肉汤。
5.7 淀粉水解培养基。
5.8 精氨酸水解培养基。
5.9 乳酸杆菌糖发酵管。
5.10 七叶苷培养基。
5.11 革兰氏染色液：按GB 4789.28规定执行。
5.12 3%过氧化氢溶液：按GB 4789.28规定执行。
5.13 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28规定执行。
5.14 明胶培养基：按GB 4789.28规定执行。
5.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB 4789.28规定执行。
5.16 生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。
6 乳酸菌菌落总数的测定
6.1 检验程序
乳酸菌菌落总数检验程序如下：
（略）
6.2 操作步骤
6.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL(或25g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1∶10的均匀稀释液。
6.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。
6.2.3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
6.2.4 选择2～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
6.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基(改良TJA或改良MC)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。
6.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征(见表1)，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取5个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10－4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为：
6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。
表1 乳酸菌在不同培养基上菌落特征
（表略）
7 乳酸菌的鉴定
对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。
7.1 菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24～48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。
7.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。
7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。
7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。
表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应
（表略）
表3 乳酸的链球菌的鉴别表
（表略）
附录A
数种专用培养基及试剂
(补充件)
A1 改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)
A1.1 成分
番茄汁 50mL
酵母抽提液 5g
肉膏 10g
乳糖 20g
葡萄糖 2g
K2HPO4 2g
吐温80 1g
乙酸钠 5g
琼脂 15g
水加至.1000mL pH6.8±0.2
A1.2 制法
番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎)，放入三角烧瓶，置4℃冰箱8～12h，取出后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入0℃冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。
制法：将所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.8±0.2。分装烧瓶，高压灭菌121℃ 15～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。
A2 改良MC培养基
A2.1 成分
大豆蛋白胨 5g
牛肉浸膏 5g
酵母浸膏 5g
葡萄糖 20g
乳糖 20g
碳酸钙 10g
琼脂 15g
蒸馏水 1000mL
1%中性红溶液 5mL
硫酸多粘菌素B(酌情而加)10万国际单位
A2.2 制法
将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6，加入中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌121℃15～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃，酌情加或不加硫酸多粘菌素B(检样有胖听或开罐后有异味等怀疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B，混匀后使用)。
A3 0.1%美兰牛乳培养基
新鲜脱脂牛乳 90mL
1%美兰水溶液 10mL
A4 6.5%氯化钠肉汤
肉浸液(PH7.6) 100mL
氯化钠 6g
A5 pH9.6葡萄糖肉汤
普通肉汤校正pH9.6加入0.2%葡萄糖。
A6 40%胆汁肉汤
pH7.6肉浸液 60mL
葡萄糖 0.12g
牛胆汁 40mL
A7 淀粉水解培养基
PH7.6肉浸液琼脂 90mL
羊血清 5mL
3%淀粉溶液 10mL
A7.1 将肉浸液琼脂溶化。
A7.2 待冷至50℃左右以无菌操作加入淀粉溶液及无菌羊血清混合后，倾注平板。
A8 精氨酸水解培养基
蛋白胨 0.1g
氯化钠 0.5g
磷酸氢二钾 0.6g
L精氨酸 1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL
琼脂 0.3g
蒸馏水 100mL
pH7.2
A9 乳酸杆菌糖发酵管
A9.1 基础成分
牛肉膏 5g
蛋白胨 5g
酵母浸膏 5g
吐温80 0.5mL
琼脂 1.5g
1.6%澳甲酚紫酒精溶液 1.4mL
蒸馏水 1000mL
A9.2 按0.5%加入所需糖类，并分装小试管。
A10 七叶苷培养基
蛋白胨 5g
磷酸氢二钾 1g
七叶苷 3g
枸橼酸铁 0.5g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL
蒸馏水 100mL
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由南京市卫生防疫站、广东省食品卫生监督检验所、上海市食品卫生监督检验所负责起草。
本标准主要起草人陈晓蔚、刘敏、杨明、宋曼丹、瞿明娟、周蓓君。
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
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