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PCR法检测支原体



录入时间:2008-11-24 15:58:37 来源:青岛银河澳门官网入口

  PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增技术,其基本原理是酶促DNA合成反应,即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA聚合酶的作用,使DNA 链扩增延伸。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速的特点,但其对实验环境的要求严格,实验成本较高,有时还有假阳性的现象出现。 
1、仪器设备 
   超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混悬器等。 
2、实验试剂 
   选用美国Stratagene公司生产的支原体检测试剂盒(内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean resin、缓冲液),dNTP,TapDNA聚合酶,缓冲液,琼脂糖,矿物油。 
3、实验操作 
  PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。 
(1)样品的收集:待测细胞用无双抗培养基培养7d,用无菌容器取上清液500ul,4℃保存待测。 
(2)模板的制作:在无菌的条件下,取细胞培养上清100ul于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子,95℃水浴加热5min。 
(3)打开盖子,向管内加StrataClean resin10ul,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5—10s,吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕,4℃保存。 
(4)PCR反应:反应体系最适条件为:10mmol/lTris-HCL(pH8.38);50mmol/lHCL;1.5-2.5mmol/lMgCL2;200umol/ldNTP;2UDapDNA聚合酶。总反应体系为50ul,反应用去离子水均需用12000uw/cm2紫外灯照射。反应如下表:
                                       表 反应程序 
      程   序             循   环             温度/℃               时间/min
                                                94                      2
          1                    1                50                      2
                                                72                      2
                                          
                                                 94                      1
           2                    40               50                      1
                                                 72                      2
①在0.5ml塑料离心管中加入35.2ul去离子水及5ul*10Taq反应缓冲液。 
②依次加入下列成分:0.4uldNTPs(25mmol/l),0.4ulTaqDNA聚合酶(5U/ul),2ul引物。 
③加2ul去离子水,总体积45ul。 
④加2ul已制成的模板到反应体系中。 
⑤阳性对照,内对照各5ul加入到各自的反应体系中。 
⑥取一支含有以上反应体系的离心管,加入5ul去离子水作为阴性对照管。 
⑦在反应体系中加入100ul矿物油。 
(5)琼脂糖凝胶电泳:PCR反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。 
(6)结果分析:该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上,MARKER、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带,当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和阴性对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染。有时还会发现一条泳道出现多条,可能是该样品感染两种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现,则可怀疑有支原体污染,重做该样品。 
   

 

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