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荧光染色法(DNA染色法)检测支原体



录入时间:2008-11-24 15:56:22 来源:青岛银河澳门官网入口

   用特异荧光染料(Hoechst33258)染色后在荧光显微镜下进行检测。荧光染料(Hoechst33258)是一种能和DNA特异结合的物质。如果检测样品为支原体污染,则附在细胞表面的支原体DNA着色,在荧光显微镜下可见。 
1、仪器设备及制剂的配制 
(1)仪器荧光显微镜,CO2培养箱,细胞培养六孔板或其他容器。 
(2)培养基:DMEM完全培养基及无抗生素的DMEM培养基。
(3)试剂 
①二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst33258)浓缩液:称取5mg二苯甲酰胺荧光染料,加入100ml不含碳酸氢钠的Hanks液中,室温下磁力搅拌30—40min,使其完全溶解,-2℃避光保存。 
②二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst33258)工作液:量取100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks液,加入1ml二苯甲酰胺浓缩液混匀。 
③固定液:乙酸:甲醇(1:3)混合液。 
2、检查方法 
(1)取出:盖玻片培养细胞汇合前从瓶中取出:细胞最好处于70%汇合,如细胞完全汇合,能影响支原体的观察。 
(2)漂洗:将细胞盖片置于培养皿中,用不含酚红的Hanks液漂洗;细胞悬液则先离心去上清营养液后,再加入Hanks液漂洗。 
(3)固定:加入固定液5ml,放置10min。 
(4)漂洗:用生理盐水或去离子水漂洗,方法同(2)。 
(5)染色:加入二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml,在室温下放置10min。 
(6)漂洗:吸出染液,用5ml水洗3次。  
(7)观察:取出盖玻片空气中干燥,细胞面向上,滴加pH5.5的磷酸缓冲液数滴,覆以盖玻片,在荧光显微镜下观察。 
3、结果判定 
   阳性结果:可见细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则荧光着色颗粒(绿色小点)。 
   当阴性结果和阳性结果均成立时,实验有效。如怀疑可疑,应重做。 

 

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