化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌及注解
中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.4－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Pseudomonas aeruginosa
绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。
1 方法提要
根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。
2 培养基和试剂
2.1 SCDLP 液体培养基
见GB 7918.1-87《化妆品微生物标准检验方法 总则》。
2.2 十六烷三甲基溴化铵培养基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
十六烷三甲基溴化铵 0.3g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4～7.6，加入琼脂，115℃(10 1b)20min灭菌后，制成平板备用。
2.3 乙酰胺培养基
成分：乙酰胺 10.0g
氯化钠 5.0g
无水磷酸氢于钾 1.39g
无水磷酸二氢钾 0.73g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g
酚红 0.012g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
制法：除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，121℃(15 1b)20min高压灭菌后，制成平板备用。
2.4 绿脓菌色素测定用培养基
成分： 蛋白胨 20g
氯化镁 1.4g
硫酸钾 10g
琼脂 18g
甘油(化学纯) 10g
蒸馏水 1000ml
制法：将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃(10 1b)20min高压灭菌后，制成斜面备用。
2.5 明胶培养基
成分： 牛肉膏 3g
蛋白胨 5g
明胶 120g
蒸馏水 1000ml
制法：取各成分加在蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经115℃(10 1b)20min灭菌后，直立制成高层备用。
2.6 硝酸盐蛋白胨水培养基
成分： 蛋白胨 10g
酵母浸膏 3g
硝酸钾 2g
亚硝酸钠 0.5g
蒸馏水 1000ml
制法：将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115℃(10 1b)20min灭菌后备用。
2.7 普通琼脂斜面培养基
成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000ml
制法：除琼脂，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，121℃(15 1b)15min高压灭菌后，制成斜面备用。
３ 仪器
3.1 培养箱：37℃、42℃。
3.2 锥形烧瓶。
3.3 试管。
3.4 灭菌平皿。
3.5 灭菌刻度吸管。
3.6 显微镜。
3.7 载玻片。
3.8 接种针、接种环。
3.9 电炉。
3.10 高压消毒锅。
4 操作步骤
4.1 增菌培养：取1：10样品稀释液10ml加到90ml SCDLP液体培养基中，置37℃培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉汤培养基。检验含防腐剂的化妆品时，在每1000ml普通肉汤中加1g卵磷脂、7g吐温80。
4.2 分离培养：从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无守型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放37℃培养24H，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带红色，其他菌不生长。
4.3 染色镜检：挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
4.4 氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液，在15～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。
4.5 绿脓菌素试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
4.6 硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
4.7 明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。
4.8 42℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养24～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
5 检验结果报告
被检样品增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和４２℃生长试验三者皆为陧性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌。
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释
注解：
（1）分离绿脓杆菌常用以下几种培养基：
1）十六烷三甲基溴化铵琼脂（CA）
2）明胶十六烷三甲基溴化铵琼脂（GCA）
成分为：蛋白陈20g，无水氯化镁1.4g，无水硫酸钾10g，明胶（BG）75g，琼脂18～20g，十六烷三甲基溴化铵（cetrimide）0.3g，甘油（CP）10ml，蒸馏水1000ml， pH7.6。在本平板上可直接观察是否液化明胶（菌落周围有液化环），并可测试氧化酶和绿脓色素，提前诊断。
上述这两种培养基具有较强的选择性和鉴别作用，除绿脓杆菌和极少数假单胞菌及革兰氏阴性杆菌可以生长外，绝大部分革兰氏阴性杆菌，假单胞菌及革兰氏阳性菌的生长，完全受到抑制。因为绿脓杆菌具有可利用十六烷的溴化铵盐这一重要特性，故很多国家已普遍利用此特性分离该菌，证明效果很好。但往往出现无色素、菌落较小、无蔓延生长等现象，因此在选取菌落时须注意，以免漏检。
3）乙酰胺琼脂培养基（Acetamide）主要成分为乙酰胺。乙酰胺酶是绿脓杆菌特有的酶类。绿脓杆菌能分解乙酰胺，故在此培养基上能生长，而其他菌不生长。
4）NAC琼脂培养基，其成分为：蛋白陈20g、磷酸氢二钾和硫酸镁各0.3g，十六烷三甲基溴化胺（cetrimide）0.2g及萘啶酸（nalidixic acid）15mg（商称NAC），琼脂15g，加蒸馏水1000m1，pH为7.4。
在NAC培养基中，绿脓杆菌生长良好，有些荧光假单胞菌，恶臭假单胞菌和腐败假单胞菌可缓慢生长或不长，而大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、克雷伯氏菌和肠道杆菌科的其他菌属、产碱杆菌属、气单胞菌属、弧菌属以及葡萄球菌和链球菌属等，完全受到抑制不能生长。因此NAC培养基是一种选择性很强的绿脓杆菌培养基。日本采用NAC培养基分离化妆品中绿脓杆菌。 CTFA采用十六烷三甲基溴化铵培养基分离绿脓杆菌。在我国化妆品标准检验方法中规定十六烷三甲基溴化铵和乙酰胺二种培养基均可使用，
这是考虑到有的地区十六烷三甲基溴化铵不易买到。
（2）绿脓杆菌与其他常见假单胞菌及革兰氏阴性杆菌的鉴别。
假单胞菌属分为四个菌群：29个代表菌种。其中同人类与动物疾病有重要关系的大约有10种，而绿脓杆菌（pseudomonas aeruginosa）又是其中最有代表性的致病菌种。常见的其他菌种有：荧光假单胞菌（PS flaorescens）、恶臭假单胞菌PS Putida）、葱头假单胞菌（PS cepacia）、类鼻疽假单胞菌（PS Pseudomallei）、嗜麦芽假单胞（PS maitophilia）、腐败假单胞菌（PS Putretf aciens）、斯氏假单胞菌（PS Stutzeri）、产碱假单胞菌（PS alcaligenes）和类产碱假单胞菌（PS Pseudoalcaligenes）等九种。此外，在日常检验工作中尚有一些非假单胞菌属的其他革兰氏阴性杆菌，如氧化木糖无色杆菌（A xy-losoxidans）、产碱杆菌属(AlcaligenesSP）和粪产碱杆菌（A faecalis）等均容易与上述假单胞菌混淆，主要鉴别列表3-1-3中。
（3）绿脓杆菌血清学试验
在微生物诸多研究方法中，血清学方法是重要方法之一，被广泛应用于实验诊断中。
对绿脓杆菌血清分型的研究，早在1903年Eisenberg就已致力于这一工作。我国也进行了大量工作，以O抗原为依据，研制成了国际抗原分型系统（IATS）20型分型血清，分型率达99.4％，是当前各国分型系统中分型率高的分型方案。
绿脓杆菌血清学试验采用玻片凝集法。先用PI～PⅣ多价血清分别与待检活菌培养物作凝集试验，阳性者再用单价分型血清作凝集试验。判断标准：立即出现强凝集（＋＋＋＋），3～5ｓ出现强凝集（＋＋＋），6～10s出现凝集（＋＋）， 11～15s出现凝集（＋）,16～30s不出现凝集（一），以（＋＋）以上为阳性结果。
对绿脓杆菌既作生化鉴定,又作血清凝集试验,更有利于结果的判定。
表3-1-3 绿脓杆和其他常见假单胞菌及革兰氏阴性杆菌的鉴别
菌种
鉴别试验
分离十六烷三甲基溴化铵培基
绿脓菌素
鞭毛染色
氧化酶
乙酰胺酶
硝酸盐还原产气
液化明胶
42℃生长试验
绿脓杆菌
+
(+)
单
+
+
+
+
+
荧光假单胞菌
-
-
多
+
－
－
+
-
恶臭假单胞菌
-
-
多
+
－
－
-
洋葱(葱头)假单胞菌
(+)
-
多
+
+
－
+
(+)
类鼻疽假单胞菌
-
-
多
+
－
－
+
+
嗜麦芽假单胞菌
-
-
多
－
－
－
+
+
腐败假单胞菌
-
-
单
+
－
－
+
(-)
斯氏假单胞菌
-
-
单
+
－
+
+
+
产碱假单胞菌
-
-
单
+
－
－
-
+
类矿产碱假单胞菌
-
-
单
+
－
－
-
+
氧化木糖无色杆菌
+
-
周
+
+
+
-
+
产碱杆菌属
(-)
-
周
+
(-)
(-)
-
+
粪产碱杆菌
+
-
周
+
+
+
-
+
注：周表示周毛茵；（）内表示大多数。
（4）检验报告
1）用十六烷三甲基溴化胺琼脂平板或乙酰胺琼脂平板分离的疑似绿脓杆菌菌落，经染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，氧化酶阳性并产生绿脓菌色素的，应报告检出绿脓杆菌。
2）如果分离的疑似菌株为革兰氏阴性无芽胞杆菌、氧化酶试验阳性，不产生绿脓菌色素，而能液化明胶，硝酸盐还原产气和42℃生长试验皆为阳性的，也应报告检出绿脓杆菌。
3）凡符合以下情况之一者，应报告未检出绿脓杆菌；
①从增菌液中未分离出任何菌落；
②分离的革兰氏阴性无芽胞杆菌，氧化酶试验阴性；
③证明不产绿脓菌色素，氧化酶阳性的革兰低阴性无芽胞杆菌，不液化明胶，硝酸盐还原产气和42℃生长试验均为阴性的细菌。
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