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游泳池水中大肠菌群检验方法



录入时间:2006-6-27 8:25:34 来源:其它

   
   一、大肠菌群多管发酵法测定
1定义
大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2 仪器
见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。
3培养基和试剂
3.1乳糖蛋白胨培养液
3.1.1成分:蛋白胨 10g
牛肉膏 2g
乳糖 5g
氯化钠 5g
1.6%(V/V)溴甲酚紫乙醇溶液 1mL
蒸馏水 1000mL
三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
3.1.2配法:将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解,调pH到]7.2~7.4。再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂,充分混匀,分装到含有倒管的试管中,115℃高压灭菌15min。
3.2伊红美兰琼脂
见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.3革兰氏染色液
风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.4染色法
见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
4推测性试验
4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。
4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。
4.3轻摇试管,使液体充分混匀,置36±1℃培养箱中,培养24h。
4.4观察每管是否产气,如不产气则报告为大肠菌群阴性;若有气体产生则为推测性试验阳性,需做进一步的证实试验。
5证实试验
5.1平板分离
自推测性检验阳性管中取一接种环培养液,接种到伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养箱培养18~24h,观察菌落形态,典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色,具有金属光泽。
5.2复发酵试验
挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,于36±1℃培养箱中,培养24h。
5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气,革兰氏染色为阴性的最大可能数(MPN)检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。
 
 
 
总大肠菌群(MPN)检索表
100mL水量的阳性管数
 100mL水量的阳性管(瓶)数 
0 1 2 
每L水样中总大肠菌群 每L水样中总大肠菌群数 每L水样中总大肠菌群数 
二、大肠菌群滤膜法测定
1 定义        
大肠菌群(coliform bacteria)为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌,将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上,经37℃培养24小时后,呈现深暗红色带金属光泽的菌落。
2仪器
2.1滤器
2.2滤膜:乳径0.45m m。直径根据滤器规格,目前常用的有35mm和27mm两种。
2.3抽滤设备
2.4无齿镊子
2.5其它仪器见《公共场所茶具的大肠菌群检验方法》
3培养基
3.1品红亚硫酸钠培养基
3.1.1成分:蛋白胨 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
琼脂 10~20g
磷酸氢二钾 3.5g
无水亚硫酸钠 5g
5%碱性品红乙醇溶液 20mL
蒸馏水 1000mL
3.1.2储备培养基的制备
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900ml蒸馏水的烧杯中,溶解后调pH值到7.2~7.4,加入琼脂加热溶解,用蒸馏水补足至1000ml,趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加入乳糖,混匀后定量分装于烧瓶内, 115℃高压灭菌20min,置冷暗处备用。
3.1.3平皿培养基的制备
将上述培养基加热融化,根据培养基的用量,碱性品戏乙醇溶液与培养基按1:50的比例,用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按1:200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个来菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解,在沸水浴中煮沸灭菌10min。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中,并充分混匀(防止产生气泡),立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内, 待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周,如培养基已由淡红色变成深红色,则不能再用。
3.2乳糖蛋白胨培养液
见《游泳池水中大肠菌群多管发酵测定法》
4操作步骤
4.1滤膜灭菌:将滤膜放入含蒸馏水的烧杯中,煮沸灭菌三次,每次15min。前两次煮混后需更换水洗涤2~3次,以除去留溶剂。
4.2滤器灭菌:用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
4.3水样过滤:用无菌镊子夹灭菌滤膜边缘部分,将滤膜粗糙面向上,贴放在滤床上。固定好滤器,将100ml水注入滤器中,打开滤器阀门。在-0.5大气压下抽滤。
4.4培养:水样滤室外后,再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器。用灭菌镊子夹滤膜边缘部分,移放在乳糖琼脂分离培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者之间不得留有气泡。然后将平皿倒置,放入36±1℃恒温箱内培养18~24h。
4.5挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色,镜检。
紫红色,具有金属光泽的菌落;
深红色,不带或略带金属光泽的菌落;
淡红色,中心色较深的菌落。
4.6将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中,于36±1℃培养48h。产酸产气者证实为大肠菌群阳性。
5检验结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数,再乘以10即为每1000ml水样中的大肠菌群数。

 

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