一、问题

  有客户反馈，购买某需煮沸灭菌的培养基，往粉末中加开水，煮沸不超过1分钟，经常出现污染。还有客户反馈，不知道怎么样算是煮沸。

  本文就煮沸灭菌培养基的制备方法和操作要领再做系统试验展示，以方便广大试验操作人员能熟练掌握这一方法。

二、试验方案

  1、有关培养基怎样完全溶解的试验

  取两种常见的培养基，VRBA和XLD，用同样的煮沸方法，分别煮至不同的温度和次数，对倒成的平板进行强度测试，从侧面反应培养基煮沸溶解的效果。

  2、有关培养基能否灭菌彻底的试验

  取三种培养基，VRBA、XLD和TSA，前两种为常见的煮沸灭菌培养基，TSA为常规需要高压灭菌的培养基。用同样的煮沸方法，分别煮沸不同的次数，将倒成的平板进行空培养，观察菌落生长情况，以直观把握培养基是否灭菌彻底。

三、试验操作与结果

  1、强度试验

 （1）称取一定量的VRBA干粉，按比例加入纯化水（凉水），充分搅拌，无成团现象后，进行加热。分别加热至60℃、70℃、80℃、90℃、100℃煮沸1次、100℃煮沸2次、100℃煮沸3次，倾倒平板，测定其强度。结果如下（表1、图1），低于100℃的情况下，倒出的平板强度较低，甚至不能完全凝固，不能满足要求。煮至100℃，平板强度明显增大，且随着煮沸次数的增多，平板强度值也会增高。至少煮沸3次，平板强度趋于稳定。

表1 VRBA培养基煮至不同温度制成的平板的强度

组别	温度（℃）	强度	分析
1	60	170	强度过低，部分溶解
2	70	156
3	80	641	强度尚可，未溶透
4	90	662
5	100-1	709	强度高，煮沸次数越多，溶解越充分
6	100-2	720
7	100-3	760

图1  VRBA培养基煮至不同温度制成的平板的强度

 （2）分别按照比例配制200mL、500mL、1000mL的VRBA培养基和XLD培养基，每个容量级分别加热煮沸1-5次，倾倒成平板后测其强度，结果如下（表2、图2），煮沸3次，强度明显增高，且煮沸次数越多，平板强度越高。煮沸至三次，平板强度趋于稳定。不同配制量的培养基，如200mL、500mL和1000mL，煮沸相同的次数，平板强度无明显差异，所以，不管配制量多少，只要培养基煮沸次数够多，即培养基充分煮透，即可满足要求。从强度来看，至少应煮沸3次。

表2 不同量的培养基煮沸不同次数制成的平板强度

培养基	煮沸次数	煮沸量与强度
		200 mL	500 mL	1000 mL
VRBA	1	628	592	633
	2	617	579	622
	3	664	669	648
	4	663	666	716
	5	674	751	673
XLD	1	816	742	760
	2	771	753	770
	3	756	769	702
	4	857	764	819
	5	799	821	790

图2-1 不同量的VRBA培养基煮沸不同次数制成的平板强度

图2-2 不同量的XLD培养基煮沸不同次数制成的平板强度

图2 不同量的培养基煮沸不同次数制成的平板强度

  2、灭菌试验

  三种培养基，不同用量分别煮沸不同的次数制成的平板，空培养后的菌落生长情况如下（图3），VRBA和XLD煮沸1-5次，平板上均无菌落生长，常规需要高压灭菌的TSA培养基煮沸1-5次，平板上均有菌落生长。因此，一般的培养基不能用煮沸的方法进行灭菌，但VRBA、XLD之类的选择性培养基，采用煮沸灭菌的方法完全可行，可有效杀灭细菌。从灭菌彻底性来说，只要煮沸1次即可满足要求。为确保万无一失，建议尽量多煮沸几次。

图3-1 VRBA培养基平板培养结果

图3-2 XLD培养基平板培养结果

图3-3 TSA培养基平板培养结果

图3 三种培养基平板空培养的结果

四、结论和煮沸状态展示

  从上面的试验可以看出，为了保证煮沸灭菌的完全溶解性和彻底灭菌性，至少应该煮沸3次。

  不同煮沸次数时，培养基的状态如图4，三种培养基均表现为：煮沸1次，泡沫多而密集；煮沸3次泡沫减少，仍布满整个液面；煮沸5次，泡沫更少，中心能看到液体。所以，为减少泡沫的产生，应该尽量多煮几次，至少煮沸3次。

  综合以上各方面考虑，实际操作中通常煮4-6次。

  实际工作中，每次煮沸的培养基的量可能会有很大差异，煮沸的指标是以煮沸次数来定的，不是以煮沸时间来判断的，只要次数足够，一定能煮出合格好用的培养基。

  有关煮沸操作的其它细节，请参考“干粉培养基煮沸灭菌的操作方法及注意事项”，相关视频可参考“培养基的加热灭菌操作”。

图4 培养基煮沸不同次数后呈现的状态

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