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引起基因工程菌质粒不稳定的原因



录入时间:2024-6-18 16:16:00 来源:青岛银河澳门官网入口

在重组菌分裂时,母细胞中的质粒在两个子代细胞中的分配往往是不均匀的,在极端情况下,其中一个子代细胞可能不含有质粒。在质粒中加入抗性标记不但能用来筛选含质粒细胞,而且也可以用于在培养过程中防止不含质粒细胞的大量繁殖。例如,若质粒上已经含有卡那霉素抗性基因,就可以在培养基中加入一定浓度的卡那霉素,这样,不含质粒细胞无法生长,而含质粒细胞的生长不受影响。另外,在质粒构建时应该加入称为 par和cer的位点,par位点能够在细胞分裂过程中使质粒分布更均匀,cer位点则能够防止多聚体质粒的形成,从而能从源头上提高质粒稳定性。若细胞中所含质粒数目较少,分裂时形成不含质粒细胞的概率就会大大增加,因此一般推荐使用高拷贝质粒。

工程菌培养的环境对质粒稳定性也有很大的影响,溶氧浓度、培养温度、培养基组成及连续培养时的稀释率等都会影响质粒稳定性,需要进行优化。一般而言,适当降低菌体的生长速率,将有利于提高重组细胞内质粒的拷贝数,防止在细胞分裂时产生不含质粒细胞。

质粒还会形成多倍体。在细胞分裂时,多倍体在子细胞中的分配只相当于一个单倍体。因此多倍体或高聚多倍体的比例越高,不含质粒细胞出现的概率也就越高。

其他造成宿主细胞丢失外源质粒的因素还有很多。大量合成的外源蛋白质会对宿主细胞的生长产生危害,含质粒细胞的生长速度总是要比不含质粒细胞的生长速度低,而且所含的质粒越多,生长速度越慢;质粒会形成多倍体,形成二倍体、四倍体等。虽然多倍体也能够复制,但是多倍体的形成减少了细胞内质粒的数目,提高了细胞分裂时产生不含质粒子细胞的概率。另一类质粒不稳定性是由质粒本身或宿主细胞的基因突变引起的。例如,由于基因突变,使有些质粒中的抗性基因有可能整合到宿主细胞的染色体DNA,使宿主细胞也获得了抗性,在这种情况下,即使在培养基中加入了抗性物质,这类不含质粒细胞也能生长。

宿主细胞的突变会引起目标蛋白质表达的下降,特另别是当质粒中的启动子受到宿主细胞所产生的某种蛋白质调节时,突变可能引起该蛋白质合成成能力的下降,使启动子的启动转录能力降低,目标蛋白的合成能力也就受到了影响。例如,当质粒采用lac启动子时,需要加入乳糖或其类似物IPTG诱导才能表达,细胞吸收乳糖或IPTG需要lac渗透酶的协助下才能通过细胞膜。如果宿主细胞发生突变使lac渗透酶失活舌,将造成诱导剂被拒之细胞外。这样虽然已经加入了诱导剂,也无法启动目标产物表达。

 

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