1．分析目标化合物
异菌脲、N－(3，5－二氯苯)－3－异丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺
2．仪器设备
带紫外分光光度检测器的高效液相色谱仪。
3．试剂
使用附录2所列试剂。
4．标准品
异菌脲：含异菌脲99％以上，熔点为135℃。
N－(3，5－二氯苯)－3－异丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺：含N－(3，5－二氯苯)－3－异丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺99％以上，熔点为200℃。
5．试验溶液的制备
a 提取方法
① 谷类、豆类及种籽类
将样品粉碎，通过420μm标准网筛后，称取其20.0g。
加入100mL乙腈，放置1小时后，搅拌3分钟，用涂布1cm厚硅藻土的滤纸抽滤，滤液移入500mL的分液漏斗(Ⅰ)中。收集滤纸上的残留物，加入100mL乙腈，搅拌3分钟，用涂布1cm厚硅藻土的滤纸抽滤，合并滤液于分液漏斗(Ⅰ)中。加入50mL乙腈饱和正己烷，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，收集乙腈层于磨口减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约30mL。
将其移入预先注入100mL 10％氯化钠溶液和100mL乙酸乙酯的500mL分液漏斗（Ⅱ）中，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙酸乙酯层移入500mL分液漏斗(Ⅲ)。水层中加入100mL乙酸乙酯，按上述同样方法操作，合并乙酸乙酯层于分液漏斗(Ⅲ)中。加入50mL 10％氯化钠溶液，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙酸乙酯层移入500mL三角瓶中。加入适量无水硫酸钠，不时振荡、混合，放置15分钟后，滤入磨口减压浓缩器中。再加入50mL乙酸乙酯洗涤上述三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残渣，重复操作二次，合并两洗涤液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙酸乙酯，残留物中加入5mL正己烷溶解。
② 水果、蔬菜和末茶
水果和蔬菜：准确称取约1kg样品，必要时定量加入适量的水，搅碎混合均匀后，称取相当于20.0g样品的量。
末茶：称取10.0g样品。
加入100mL丙酮，搅拌3分钟后，用涂布1cm厚硅藻土的滤纸，抽滤于磨口减压浓缩器中。取出滤纸上的残留物，加入100mL丙酮，搅拌3分钟后，按上述同样操作，合并滤液于磨口减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约50mL。
加入5mol/L的氢氧化钠溶液，调整pH6～7，移入预先注入100mL 10％氯化钠溶液和100mL乙酸乙酯的500mL分液漏斗(Ⅰ)中。用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙酸乙酯层移入500mL分液漏斗（Ⅱ）中。水层中加入100mL乙酸乙酯，按上述同样方法操作，合并乙酸乙酯层于分液漏斗（Ⅱ）中。加入50mL 10％氯化钠溶液，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙酸乙酯层移入500mL三角瓶中，加入适量无水硫酸钠，不时振摇、混合，放置15分钟后，滤入磨口减压浓缩器中。再加入50mL乙酸乙酯洗涤三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，重复操作二次，合并两洗涤液于减压浓缩器中，40℃以下除去乙酸乙酯，残留物中加入5mL正己烷溶解。
③末茶以外的茶
将10.0g样品浸泡在600mL 100℃水中，室温下放置5分钟后，过滤，移取300mL冷却后的滤液于500mL三角瓶(I)中。加入100mL丙酮和2mL饱和乙酸铅溶液，轻轻振荡15分钟后，用涂布1cm厚硅藻土的滤纸抽滤于1000mL分液漏斗中。再加入50mL丙酮：水（1∶1）混合液洗涤三角瓶(Ⅰ)，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，合并洗涤液于上述分液漏斗中。加入20g氯化钠和100mL正己烷，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，正己烷层移入500mL分液漏斗。水层中加入100mL正己烷，按上述同样方法操作，合并正己烷层于上述分液漏斗中。
加入50mL 10％氯化钠溶液，用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，正己烷层移入500mL三角瓶中（II）中。加入适量无水硫酸钠，不时振荡、混合，放置15分钟后，滤入磨口减压浓缩器中。再加入50mL正己烷洗涤三角瓶（II），以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，重复操作二次，合并两洗涤液于减压浓缩器中，40℃以下除去正己烷，残留物中加入5mL正己烷溶解。
b 净化方法
在内径20mm，长300mm的色谱管中注入10g悬浮在正己烷中的柱色谱用合成硅酸镁，其上面再装入约8g无水硫酸钠,放出正己烷至柱上端留有少量正己烷。柱中注入a 提取方法所得的溶液后，注入100mL乙醚：正己烷（1∶1）混合溶液,弃去流出液。再注入100mL丙酮：正己烷（3∶17）混合溶液,收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去正己烷，残留物中加入乙腈溶解，准确至5mL，此为试验溶液。
6．操作方法
a 定性试验
按下列操作条件进行试验，试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm)。
柱：内径4.5mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 25℃
检测器：波长230nm。
流动相：乙腈：水(3：2)混合溶液。调整流速使异菌脲约9分钟流出。
b 定量试验
根据与a 定性试验同样操作条件所得试验结果，用峰高法或峰面积法分别对异菌脲和N－(3，5－二氯苯)－3－异丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺进行定量，由异菌脲和N－(3，5－二氯苯)－3－异丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺的和求得异菌脲的含量。
7．定量限
0.05 mg/kg
8．注意事项
对异菌脲及其代谢物N－(3，5－二氯苯)－3－异丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺分别进行定量，它们的和为异菌脲分析值。
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