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支原体肉汤培养基的原理和使用方法

刘浩然
录入时间:2023-4-4 9:30:38 来源:青岛银河澳门官网入口

一、支原体简介

  支原体结构简单,缺乏细胞壁,仅有质膜,胞体内有核蛋白体以及一个由环形双链DNA分子组成的原核。大小仅有0.1~0.3μm,最小直径约为100毫微米,可通过滤菌器,会干扰细胞培养等工作的进行。由于能形成丝状与分枝形状,故称为支原体。

  不同支原体利用的能源物质不同,如发酵葡萄糖的肺炎支原体、人型支原体等,水解精氨酸的口腔支原体等,还有利用尿素作为能源的解脲支原体。可利用发酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反应鉴别支原体。

  支原体营养要求一般比细菌高,除必须的基础营养物质外,还需添加10%~20%的动物血清以提供支原体所需的胆固醇。由于大多数的支原体兼性厌氧,有些菌株在活化分离时保持5%~10%二氧化碳环境生长状态更好。解脲支原体在厌氧条件下生长更好。

  支原体无细胞壁,对渗透压敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感,因此可添加青霉素抑制细菌的生长。由于渗透压突变会导致支原体破裂死亡,因此培养支原体时,维持适宜的渗透压显得格外重要。此外,在支原体培养中,pH也是重要因素。


二、肺炎支原体检验依据及培养基原理

  支原体检查法在2020年版《中华人民共和国药典》中体现,要求使用支原体肉汤培养基培养监测肺炎支原体。具体操作要求为:将肺炎支原体稀释至10-7~10-9,接种在支原体肉汤培养基中,每个稀释度接种3支试管,置于36℃培养7-14天,观察培养基变色结果。肺炎支原体可以发酵培养基中的葡萄糖,使培养基的pH值降低,遇指示剂酚红使培养基变黄。

  猪胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子;葡萄糖为可发酵的糖类;氯化钠维持渗透压;酚红为指示剂。


三、培养基配方(g/L)

猪胃消化粉

10.0

牛肉浸粉

5.0

酵母浸粉

5.0

氯化钠

2.5

葡萄糖

5.0

酚红

0.02

pH 7.6±0.2(25℃)


四、试验方法

  1、称取本品27.52g,加热溶解于800mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟,冷至室温,无菌操作加入灭活小牛血清或马血清200mL和青霉素80万单位,混匀,分装无菌试管,备用。

  2、制备质控菌株,接种到培养基中,并梯度稀释至-9,并做空白对照。

  3、放置于36℃±1℃恒温培养箱中,需氧培养7-14天。


五、试验注意事项

  1、若使用非一次性试管等容器进行试验,容器使用前应使用蒸馏水冲洗干净,确保无洗涤液等残留物,以免增加试验的不确定性或污染。

  2、灭菌结束后,试管口会有水珠,在进行梯度稀释时,水珠很容易与空气中的细菌接触以致污染,因此,试管口应灼烧至干燥,胶塞也需过火,振荡操作后,若培养基接触到胶塞,还需再次进行灼烧管口。

  3、调节pH时,使用的酸碱试剂均应是灭菌后的。

  4、支原体培养前应使用封口膜封口,可提供微需氧环境以及降低污染的风险。


六、质控结果

  接种以下质控菌株,放置于36℃±1℃恒温培养箱中,需氧培养7~14天。培养至12天的试验结果如图1所示。

质控菌株

菌株编号

接种量(CFU)

生长情况

其它特征

肺炎支原体

ATCC 15531

/

+++

10(-9)稀释度变黄色


支原体肉汤培养肺炎支原体12天的灵敏度

图1 支原体肉汤培养肺炎支原体12天的灵敏度


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