一、支原体简介
支原体结构简单,缺乏细胞壁,仅有质膜,胞体内有核蛋白体以及一个由环形双链DNA分子组成的原核。大小仅有0.1~0.3μm,最小直径约为100毫微米,可通过滤菌器,会干扰细胞培养等工作的进行。由于能形成丝状与分枝形状,故称为支原体。
不同支原体利用的能源物质不同,如发酵葡萄糖的肺炎支原体、人型支原体等,水解精氨酸的口腔支原体等,还有利用尿素作为能源的解脲支原体。可利用发酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反应鉴别支原体。
支原体营养要求一般比细菌高,除必须的基础营养物质外,还需添加10%~20%的动物血清以提供支原体所需的胆固醇。由于大多数的支原体兼性厌氧,有些菌株在活化分离时保持5%~10%二氧化碳环境生长状态更好。解脲支原体在厌氧条件下生长更好。
支原体无细胞壁,对渗透压敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感,因此可添加青霉素抑制细菌的生长。由于渗透压突变会导致支原体破裂死亡,因此培养支原体时,维持适宜的渗透压显得格外重要。此外,在支原体培养中,pH也是重要因素。
二、肺炎支原体检验依据及培养基原理
支原体检查法在2020年版《中华人民共和国药典》中体现,要求使用支原体肉汤培养基培养监测肺炎支原体。具体操作要求为:将肺炎支原体稀释至10-7~10-9,接种在支原体肉汤培养基中,每个稀释度接种3支试管,置于36℃培养7-14天,观察培养基变色结果。肺炎支原体可以发酵培养基中的葡萄糖,使培养基的pH值降低,遇指示剂酚红使培养基变黄。
猪胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子;葡萄糖为可发酵的糖类;氯化钠维持渗透压;酚红为指示剂。
三、培养基配方(g/L)
猪胃消化粉 |
10.0 |
牛肉浸粉 |
5.0 |
酵母浸粉 |
5.0 |
氯化钠 |
2.5 |
葡萄糖 |
5.0 |
酚红 |
0.02 |
pH 7.6±0.2(25℃) |
四、试验方法
1、称取本品27.52g,加热溶解于800mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟,冷至室温,无菌操作加入灭活小牛血清或马血清200mL和青霉素80万单位,混匀,分装无菌试管,备用。
2、制备质控菌株,接种到培养基中,并梯度稀释至-9,并做空白对照。
3、放置于36℃±1℃恒温培养箱中,需氧培养7-14天。
五、试验注意事项
1、若使用非一次性试管等容器进行试验,容器使用前应使用蒸馏水冲洗干净,确保无洗涤液等残留物,以免增加试验的不确定性或污染。
2、灭菌结束后,试管口会有水珠,在进行梯度稀释时,水珠很容易与空气中的细菌接触以致污染,因此,试管口应灼烧至干燥,胶塞也需过火,振荡操作后,若培养基接触到胶塞,还需再次进行灼烧管口。
3、调节pH时,使用的酸碱试剂均应是灭菌后的。
4、支原体培养前应使用封口膜封口,可提供微需氧环境以及降低污染的风险。
六、质控结果
接种以下质控菌株,放置于36℃±1℃恒温培养箱中,需氧培养7~14天。培养至12天的试验结果如图1所示。
质控菌株 |
菌株编号 |
接种量(CFU) |
生长情况 |
其它特征 |
肺炎支原体 |
ATCC 15531 |
/ |
+++ |
10(-9)稀释度变黄色 |
图1 支原体肉汤培养肺炎支原体12天的灵敏度
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