β-半乳糖苷酶是细菌利用乳糖的关键酶。细菌分解乳糖主要依靠两种酶的作用，一种是β-半乳糖苷酶渗透酶，这种酶作用于细胞膜上，可以让乳糖进入细胞，而另一种就是β-半乳糖苷酶，这种酶位于细胞内，使乳糖分解成半乳糖和葡萄糖。
同时具有上述两种酶的细胞，可以在24-48h内发酵乳糖，同时缺乏上述两种酶的细菌，不能分解乳糖。而部分细菌只具有β-半乳糖苷酶（如宋内志贺氏菌、亚利桑那沙门氏菌），而不具有β-半乳糖苷酶渗透酶，因此乳糖进入细胞很慢，宏观表现则为迟缓发酵乳糖（通常需要3-7天）。在《GB4789.5-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》中，提供了两种检测细菌是否含有β-半乳糖苷酶的方法。
1. 液体法（ONPG法）
所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌，都可以快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。因而利用ONPG可以快速检测迟缓发酵乳糖的菌株。
培养基成分：
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ONPG |
60.0mg |
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0.01mol/L磷酸钠缓冲液（PH7.3-7.7） |
10.0ml |
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1%蛋白胨水（PH7.3-7.7） |
30.0ml |
制法：
将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管内，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。
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试验方法：
挑取培养物一满环接种，于36℃±1℃培养1h-3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h-3h变黄色，如无此酶则24h不变色。ONPG在固体培养基中分解后的显色终产物会大面积扩散，因此只适用于液体培养基。
2. 平板法（X-Gal法）
利用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）作为显色底物，如果细菌含有β-半乳糖苷酶，则分解显色底物，平板上的培养物变蓝色。如不含此酶，则菌落呈无色或不透明色。
培养基成分：
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蛋白胨 |
20.0g |
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氯化钠 |
3.0g |
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5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal） |
200.0mg |
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琼脂 |
15.0g |
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蒸馏水 |
1000.0ml |
制法：
将各成分加热煮沸于1L蒸馏水中，冷却至25℃左右校正pH至7.2±0.2,115℃高压灭菌10min，倾注平板避光冷藏备用。
试验方法：
挑取培养物接种于平板，划线或点种皆可，于36℃±1℃培养18-24h观察结果。如果有β-半乳糖苷酶产生，则平板上菌落呈蓝色。如不含此酶，则菌落呈无色或不透明色。培养48h-72h后，有部分转为淡粉色。
X-Gal在液体和固体里中检测β-半乳糖苷酶的活性比其他显色或荧光底物更有效。
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