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两种β-半乳糖苷酶的测定方法

王天宇
录入时间:2023-2-16 10:48:50 来源:青岛银河澳门官网入口

  β-半乳糖苷酶是细菌利用乳糖的关键酶。细菌分解乳糖主要依靠两种酶的作用,一种是β-半乳糖苷酶渗透酶,这种酶作用于细胞膜上,可以让乳糖进入细胞,而另一种就是β-半乳糖苷酶,这种酶位于细胞内,使乳糖分解成半乳糖和葡萄糖。

  同时具有上述两种酶的细胞,可以在24-48h内发酵乳糖,同时缺乏上述两种酶的细菌,不能分解乳糖。而部分细菌只具有β-半乳糖苷酶(如宋内志贺氏菌、亚利桑那沙门氏菌),而不具有β-半乳糖苷酶渗透酶,因此乳糖进入细胞很慢,宏观表现则为迟缓发酵乳糖(通常需要3-7天)。在《GB4789.5-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》中,提供了两种检测细菌是否含有β-半乳糖苷酶的方法。


1. 液体法(ONPG法)

  所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌,都可以快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黄色的邻硝基酚。因而利用ONPG可以快速检测迟缓发酵乳糖的菌株。

  培养基成分:

ONPG

60.0mg

0.01mol/L磷酸钠缓冲液(PH7.3-7.7)

10.0ml

1%蛋白胨水(PH7.3-7.7)

30.0ml

  制法:

  将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于10mm×75mm试管内,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。

  也可直接购买我司安瓿瓶装的ONPG生化管 点击查看。

  试验方法:

  挑取培养物一满环接种,于36℃±1℃培养1h-3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生,则于1h-3h变黄色,如无此酶则24h不变色。ONPG在固体培养基中分解后的显色终产物会大面积扩散,因此只适用于液体培养基。

液体法(ONPG法)


2. 平板法(X-Gal法)

  利用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)作为显色底物,如果细菌含有β-半乳糖苷酶,则分解显色底物,平板上的培养物变蓝色。如不含此酶,则菌落呈无色或不透明色。

  培养基成分:

蛋白胨

20.0g

氯化钠

3.0g

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)

200.0mg

琼脂

15.0g

蒸馏水

1000.0ml

  制法:

  将各成分加热煮沸于1L蒸馏水中,冷却至25℃左右校正pH至7.2±0.2,115℃高压灭菌10min,倾注平板避光冷藏备用。

  试验方法:

  挑取培养物接种于平板,划线或点种皆可,于36℃±1℃培养18-24h观察结果。如果有β-半乳糖苷酶产生,则平板上菌落呈蓝色。如不含此酶,则菌落呈无色或不透明色。培养48h-72h后,有部分转为淡粉色。

  X-Gal在液体和固体里中检测β-半乳糖苷酶的活性比其他显色或荧光底物更有效。

在X-Gal上产生β-半乳糖苷酶的菌落状态


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相关标准:

GB 4789.5-2012 志贺氏菌检验 -标准下载


注:本文属银河澳门官网入口原创,未经允许不得转载。

 

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