【原理】
将抗原或抗体致敏在胶乳微粒上,此胶乳即具有免疫学性质,称为免疫胶乳,当致敏的抗原胶乳与相应抗体相遇时,在有电解质的条件下,抗原很快和抗体结合,从而胶乳微粒被动地凝集起来,称为胶乳凝集试验。
将待测抗原样品中先加入一定量的抗体,反应一段时间,再加入抗原胶乳,先加入的两种成分因是对应的而结合起来,抑制了抗原胶乳与抗体的凝集反应,称为胶乳凝集抑制试验。
用抗体致敏胶乳直接测定抗原的方法,称为反向胶乳凝集试验。
【成分】
聚苯乙烯胶乳
若干ml
胰酶若
干g
硼酸缓冲盐水
若干ml
炭疽杆菌抗血清
若干ml
pH8.4甘氨酸缓冲液
若干ml
人γ球蛋白
若干mg
羧基聚苯乙烯胶乳
若干ml
pH7.2磷酸盐缓冲液
若干ml
羊抗免IgG抗体
若干mg
碳化二乙胺
若干mg
【制法】
1.聚苯乙烯免疫胶乳的制备:上海第六人民医院检验科曾对聚苯乙烯胶乳的制备、筛选以及致敏等问题作过详细的介绍.现有商品出售可不必自行制备。以下例举两种方法制备免疫聚苯乙烯胶乳的方法。
(1)胰酶处理聚苯乙烯胶乳致敏炭疽抗血清:
①聚苯乙烯胶乳的处理:取10%聚苯乙烯胶乳1ml,加蒸水4ml稀释成2%,再加pH8.2硼酸缓冲盐水(BBS)12ml 和1%胰酶溶液2ml,充分混合,置45℃水浴中约18小时,7500rpm离心30分钟,去上清,加pH8.2 BBS10ml,制成1%胶乳备用。
②将炭疽杆菌抗血清于56℃水浴中加温30分钟,用pH7.2磷酸盐缓冲液稀释为1:20,取0.2ml加在1ml上述胰酶处理的胶乳中,于56℃水浴中致敏2小时,再置于室温下稳定4小时。
对照胶乳用正常血清按上述条件致敏。
③影响制备炭疽抗血清胶乳的因素:为了防止聚苯乙烯胶乳自凝现象的出现和提高对抗血清的吸附并减少免疫胶乳的非特异反应,聚苯乙烯胶乳用胰酶处理后再致敏。而胰酶处理的胶乳要于3天内使用,否则吸附血清的能力明显下降;致敏温度对制备理想免疫胶乳有明显影响,以56℃水浴致敏30分钟为宜,低于45℃则发生不同程度的自凝;致敏的抗血清浓度过大,免疫胶乳的敏感性下降,浓度过低,则发生自凝,因此选择合适的致敏抗血清浓度甚为重要。
(2)直接致敏人IgG:类风湿因子(RF)是类风湿性关节炎患者血清中的一组异常的免疫球蛋白,能和IgG的FC部分呈特异性反应。将人IgG结合在胶乳微粒上,当与患者血清反应后,免疫胶乳即出现凝集反应,说明患者血清中有类风湿因子。
①致敏方法:取10%聚苯乙烯胶乳1ml,加0. 1mol pH8.4甘氨酸缓冲液4ml,作1：5稀释;另将人γ球蛋白稀释为12.5mg/ml,二者等量相加,混均,在室温放置过夜,加0.1%叠氮钠防腐，即成类风湿因子免疫胶乳制剂。
致敏胶乳不必洗涤,直接用于试验。
②影响类风湿因子免疫胶乳质量的因素:致敏用的γ球蛋白量要合适，γ球蛋白浓度过高，免疫胶乳容易发生自凝,过低则检出的敏感性下降；免疫胶乳稳定性的关键是甘氨酸缓冲液中不含NaCl,否则致敏后数天,免疫胶乳就出现自凝;在检测样品时,为了获得良好结果,缓冲液中须含有0.85%NaCl;致敏时,pH8. 4的甘氨酸缓冲液比pH8.2效果好。
(2)羧基聚苯乙烯免疫胶乳的制备:羧基聚苯乙烯胶乳是以苯乙烯为基本单体,聚合反应的条件与聚苯乙烯胶乳基本相同,在反应的适当时机引入少量丙稀酸作为羧基的来源,通过聚合获得羧基聚苯乙烯胶乳。
这种免疫胶乳,抗原或抗体是以化学键共价交联在颗粒上的,这种化学结合比较牢固,而且结合的抗原或抗体量也比较多,特异性也较好,扩大了胶乳试验的应用范围。例如HCG-羧基胶乳,链球菌溶血素“O”-羧基聚苯乙烯胶乳等。关于制备免疫羧基聚苯乙烯胶乳的操作步骤,文献报告均不够详细,总的来看,基本上采用两步法,即第1步接“手臂”,第2步联结抗原或抗体,今以制备羊抗兔IgG-羧基聚苯乙烯胶乳为例,将该法介绍如下。
1.接“手臂"：取10%羧基胶乳1ml,加 0.2mol pH7.2磷酸盐缓冲液1ml，0.025molε氨基乙酸2ml和碳化二乙胺4mg,室温下轻轻搅拌2小时.8000rpm离心30分钟,去上清留沉淀。
2.联结抗体：上述胶乳用0.1mol pH7.6磷酸盐缓冲液恢复至原体，加入羊抗兔IgG抗体2mg和碳化二乙胺6mg,在4℃冬件下轻轻搅拌6小时以上，离心去上清,用0.13molpH8.2硼酸缓冲液(含0.85%NaCl)洗1次,用同样缓冲液恢复至原体积,即制成了羊抗兔IgG抗体-羧基聚苯乙烯胶乳。
【用途】
胶乳凝集试验因具有快速、简便和敏感、特异等优点,目前已广泛的用于各种抗原和抗体的检测。
【注意事项】
1.胶乳悬液保存时,放在4～6℃冰箱中,不能放在低温冰箱使之冻结。
2.本试验易受pH的影响,在pH5.5～8.0的范围内,胶乳颗粒易发生非特性凝集,使用的溶液pH在8.2～8.4较好。
3.每批试验应设置阴性对照和阳性对照。
4.如用玻片法时还应注意:
①不能摇的时间太长,时间过长,因蒸发的关系悬液边缘出现干的凝胶,这容易误判。一般于0.5～2分钟而出现凝集。
②不能摇动太剧烈,有些反应形成的凝集比较脆弱,剧烈的摇动。会使已形成的凝集破坏。
上一篇：全胎消化液培养基
下一篇：致敏红细胞
