一、铜绿假单胞菌情况简要介绍
铜绿假单胞菌（拉丁文名Pseudomonas aeruginosa）广泛分布于水、空气、土样以及正常人体皮肤、呼吸道与肠道黏膜中，为条件致病菌。本菌为无荚膜、无芽孢、能运动的革兰阴性菌，形态不一，成对排列或短链状，为专性需氧菌，最适宜生长温度为37℃，致病性铜绿假单胞菌该菌在4℃不生长而在42℃可以生长，据此可与荧光假单胞菌等进行鉴别，本菌生长对营养要求不高。
本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。
二、参考标准
《GB8538-2016 饮用天然矿泉水：铜绿假单胞菌检验》
三、检验原理
采用滤膜法，将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃±1℃恒温箱中培养48h，典型菌落能够在CN琼脂选择性培养基上生长并产生绿脓菌素，或者能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光360nm±20nm照射下能发荧光，能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
四、检验方法以及结果分析
铜绿假单胞菌检验程序见图1。
图1 铜绿假单胞菌检验程序
4.1操作步骤
4.1.1 水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
4.1.2 培养
将平板倒置于36℃±1℃培养24h~48h，并防止干燥。
4.1.3 结果观察
在培养20h~24h和40h~48h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数。
铜绿假单胞菌在CN琼脂平板上为蓝绿色菌落，如下图所示：
图2 铜绿假单胞菌在CN琼脂平板上的菌落特征
计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）疑似铜绿假单胞菌的菌落，并进行绿脓菌素确证性试验。
在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确证性试验。
将其他所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、乙酰胺液体培养基、金氏B培养基确证性试验，培养20h~24h观察结果，防止因为培养40h~48h导致菌落过分生长而出现菌落融合。
最终的铜绿假单胞菌菌落计数应按4.4中的公式进行计算。
在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤见表1。
表1 在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤
4.2 确证性试验
4.2.1 营养琼脂
尽可能将所有经滤膜过滤后，在36℃±1℃培养了20h~24h，将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养20h~24h。检查再次纯化的菌落，并将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验。
4.2.2 氧化酶试验
取2滴~3滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上，用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上，在10s内显深蓝紫色的视为阳性反应。
图3 氧化酶试验结果
备注：A：铜绿假单胞菌；B：阴性对照
4.2.3 金氏B（King's B）培养基
将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上，于36℃±1℃恒温箱培养24h~5d。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。
图4 金氏B培养基检测结果
4.2.4 绿脓菌素试验
取可疑菌落2个~3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置36℃±1℃培养24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内，待三氯甲烷提取液呈蓝色时，用吸管将三氯甲烷移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
图5 铜绿假单胞菌在绿脓菌素测定培养基中生长情况
4.2.5 乙酰胺液体培养基
将4.2.1中的纯培养物接种到装有乙酰胺液体培养基的试管中，在36℃±1℃下培养20h~24h。然后向每支试管培养物加入1滴~2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。
图6 铜绿假单胞菌乙酰胺液体培养基生长情况
备注：A：大肠杆菌；B：铜绿假单胞菌ATCC 27853；C：铜绿假单胞菌ATCC 9027
4.3 计数
将产生绿脓色（蓝色/绿色）或氧化酶反应呈阳性、在紫外灯下产生荧光（4.1.3或4.2.3），且在乙酰胺肉汤中产氨的所有菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。通过计数培养后的滤膜上的菌落以获得铜绿假单胞菌的数量，其他呈红褐色的菌落需要进一步验证。
4.4 结果与报告
滤膜上的特征菌落可证实为铜绿假单胞菌的菌落。计算菌落数时应考虑到验证试验的比例及特定的水量，过滤的水样的体积应为250mL。
式中：
P —呈蓝/绿色的菌落数；
F —显荧光的菌落数；
cF—产氨阳性的显荧光菌落数；
nF—进行产氨测试的显荧光菌落数；
R —呈红褐色的菌落数；
cR—产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数；
nR—进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。
根据蓝色或绿色菌落的计数（4.1.3）和确证性试验的结果（4.2），计算每250mL水样中的铜绿假单胞菌数量，结果以CFU/250mL计。
4.5 其他
如铜绿假单胞菌污染严重或培养时间过长时，菌落可能蔓延而影响计数。
检验及计数过程中应以铜绿假单胞菌标准菌株作为阳性对照菌株，以荧光假单胞菌标准菌株作为阴性对照菌株。
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