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聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂



录入时间:2021-10-13 16:10:30 来源:现代微生物培养基和试剂手册

【原理】

  聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺与N , N-次甲基双丙烯酰胺(bis)在催化剂四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵作用下聚合而成,通过两者浓度的改变可形成不同孔径的筛孔,聚丙烯酰胺凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重作用,能精细分离蛋白及核酸。十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子去污剂,它与蛋白质的疏水区相结合,可使蛋白呈一致的强负电荷,所以可增加聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力。


【成分】

  (1) A:30%丙烯酰胺

丙烯酰胺

30g

N, N-次甲基双丙烯酰胺

0.8g

加水至

100ml

4℃避光保存

  (2)B液:1.5mol Tris · HCl ,pH8.8。

  (3)C液:10%SDS。

  (4)D液:0.5mol Tris · HCl ,pH6.8。

  (5)四甲基乙二胺(TEMED):原液。

  (6)10%过硫酸胺:4℃保存,二星期内使用。

  (7)电泳液:

Tris

6g

甘氨酸

28.8g

10%SDS

10ml

加双蒸馏水至

1000ml

调至pH8.8

  (8)染色液:

0.2%考马斯蓝

若干ml

50%甲醇

若干ml

7%乙酸

若干ml

  (9)脱色液:

50%甲醇

若干ml

7%乙酸

若干ml

  (10)样本缓冲液:

0.05mol Tris. HCl ,pH6.8

若干ml

0. 1%SDS

若干ml

10%甘油

若干ml

0.1%二巯基乙醇

若干ml

0.002%溴酚蓝

若干ml

【制法】

  1. 分离胶的配制:见表44—1。

  2. 4%的样品胶的配制(100ml):

A

13.3ml

B

12.5ml

C

1.0ml

双蒸馏水

72.2ml

TEMED

50μl

10%过硫酸铵

1.0μl


44—1聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)的配制

凝胶浓度

2.5

5

7.5

10

13

15

20(100ml)

A(ml)

8.3

16.7

25.0

33.3

43.3

50.0

66.7

B(ml)

12.5

12.5

12.5

12.5

12.5

12.5

12.5

C(ml)

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

双蒸馏水(ml)

78.0

69.6

61.3

53.0

43.0

36.3

19.6

TEMED (μl)

50.0

50.0

50.0

50.0

50.0

50.0

50.0

10%过硫酸铵(ml)

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2


【用途】

  聚丙烯酰胺凝胶电泳用于蛋白质或核酸的纯度、含量和分子量大小的鉴定和分析,也可用于蛋白质、核酸的纯化。其浓度与有效分辨率之间的关系见表44—2。

44—2丙烯酰胺浓度及其有效分辨范围

丙烯酰胺

浓度(%)

有效分辨范围

核甘酸数

蛋白分子量(道尔顿)

3.5

100~1000

5.0

80~500

2.5~20.0X104

8.0

60~400

10.0

1.5~7.0X104

12.0

40~200

15.0

1.2~4.5X104

20.0

10~100


【注意事项】

  1. 电泳过程中,电压过高,会使凝胶发热。一般以较低电压,较长时间的效果为好。

  2. 丙烯酰胺是神经毒物质,可经呼吸道或皮肤进入人体。实验操作时要戴手套,避免用口吸取溶液。

  3. 凝胶板在电泳槽中固定后,用丁形玻璃管赶走底部气泡,至为重要。若有气泡,则凝胶中的蛋白或核酸带易产生弯曲。

  4. 在进行蛋白凝胶电泳时,必须用已知分子量大小的蛋白作为分子量标记,同时进行电泳。常用的分子量标记为:

卵白蛋白

43000道尔顿

α-糜蛋白酶原

25700道尔顿

β-乳球蛋白

18400道尔顿

溶菌酶

14300道尔顿

细胞色素C

12300道尔顿

牛胰蛋白酶抑制物

6200道尔顿

胰岛素(AB)

~3000道尔顿

(第二军医大学 刘沪丽供稿全章 由第二军医大学 谢正旸审编)

 

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