一、大肠菌群简介
大肠菌群是革兰氏阴性、无芽孢、氧化酶阴性的杆状细菌，为需氧和兼性厌氧，可在有胆盐（或具有其他抑制生长的表面活性剂）存在的情况下生长，通常可在36℃士2℃发酵乳糖并产酸和醛。主要由肠杆菌科中四个属内的一些细菌所组成，即埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属以及肠杆菌属。
大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。如果大肠菌群存在于食品中，表明未作有效的消毒处理、加工后保存条件不良或消毒后又受到污染。快速检验这些细菌，有助于食品的卫生管理，维护消费者的食用安全。
二、参考标准
《GB8538-2016 饮用天然矿泉水：大肠菌群检验》
三、检验原理
3.1 多管发酵法
根据大肠菌群细菌具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃培养24h能发酵乳糖并产气的特点，将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中，经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的最可能数(MPN)。
3.2 滤膜法
采用孔径为0.45μm水相微孔薄膜，将水中所含的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性鉴别培养基上，经37℃培养24h后，大肠菌群细菌在滤膜上长出具有特征性的菌落，直接计数典型菌落数，计算出每100mL水样中所含的大肠菌群数。
大肠菌群可产生β-半乳糖苷酶，分解培养基中的酶底物-茜素-β-D-半乳糖苷（以下简称Aliz-gal），使茜素游离并与固体培养基中的铝、钾、铁、铵离子结合形成紫色（或红色）的鳌合物，使菌落呈现相应的颜色。
四、检验方法以及结果分析
4.1 多管发酵法
大肠菌群多管发酵法检验程序见图1。
图1 大肠菌群检验程序
4.1.1 矿泉水水源水检测
4.1.1.1 推测性检验
a) 吸取10mL水样接种到盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，共接种5份；
b) 吸取1mL水样接种到盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，共接种5份；
c) 吸取1mL水样接种到9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀，用5mL灭菌吸管吸取5mL稀释液，分别加到5支盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，每管1mL(即0.1mL水样)；
d) 轻摇试管，使液体充分混合，置36℃±1℃培养箱内培养25h。观察每管是否产气，若有气体产生该管则为推测性检验阳性，如不产气则为大肠菌群阴性。
质控菌株接种到乳糖胆盐发酵培养基管中，培养结果如下图所示：
图2 标准菌株在乳糖胆盐发酵培养基中生长情况
4.1.1.2 确证性试验
a) 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到亮绿乳糖胆盐培养液(BGLB)管中，置36℃±1℃培养箱中培养48h；
b) 观察BGLB管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为“大肠菌群阳性”；如无气体产生则为“大肠菌群阴性”。记下BGLB管里产气的阳性试管数，查MPN表可得出水样中大肠菌群的MPN值。
质控菌株接种到BGLB管中，培养结果如下图所示：
图3 大肠菌群在BGLB肉汤中生长情况
4.1.1.3 MPN值的计算
如水样含菌量少，也可按100mL、10mL、1mL接种，那么其实际MPN值应为表中的MPN值除以10；反之如含菌量较多，也可接种1mL、0.1mL、0.01mL，其实际MPN值应为表中的MPN值乘以10，余此类推。
4.1.1.4 列举说明
假设推测性检验15支试管中的阳性管数如下:①在接种量为10mL的管中有5支管阳性；②在接种量为1mL的管中有4支管阳性；③在接种量为0.1mL的管中有2支管阳性；
作为推测性检验结果为5-4-2。当把以上阳性管转种到BGLB管里，经培养后，作为证实性检验所给的结果如为5-3-1，那么查MPN表，就可知大肠菌群的MPN值为每100mL水样中110。接种量为100mL、10mL、1mL时，MPN值为11。如接种量为1mL、0.1mL、0.01mL时，MPN值即为1100。
表1 大肠菌群(MPN)检索表（部分）
(总接种量55.5mL，其中5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样)
4.1.2 直接饮用的矿泉水的检测
矿泉水出厂成品水或准备直接饮用的矿泉水，一般不应有污染，需要经常检验，可按下法进行接种。
4.1.2.1 推测性检验
a) 用10mL的灭菌吸管向5支盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液的试管中，每管接种10mL水样。
b) 置36℃±1℃培养箱中培养24h，观察每支管的产气情况，如有气体产生，则认为推测性检验阳性。
4.1.2.2 确证性试验
操作步骤同矿泉水水源水检验。
4.1.2.3 MPN值的计算
当经过证实性检验后，5管10mL水样结果中，阳性反应的管数对应的MPN 值及其95%的可信限范围见表2。
表2 用5管10mL水样时各种阳性和阴性结果组合的MPN值及其95%的可信限
|
阳性反应管数 |
MPN/100mL |
95%可信限 |
|
|
下限 |
上限 |
||
|
0 |
0 |
0 |
6.0 |
|
1 |
2.2 |
0.1 |
12.6 |
|
2 |
5.1 |
0.5 |
19.2 |
|
3 |
9.2 |
1.6 |
29.4 |
|
4 |
16 |
3.3 |
56.9 |
|
5 |
>16 |
8.0 |
无限 |
4.2 滤膜法
4.2.1 操作步骤
4.2.1.1 用灭菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样(如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释)注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07×104 Pa（负0.5大气压）下抽滤。
4.2.1.2 水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入36℃±1℃恒温箱内培养24h±2h。
4.2.1.3 观察滤膜上面的菌落特征。大肠菌群典型菌落在远藤培养基上具有以下特征：
a) 紫红色，具有金属光泽的菌落；
b) 深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
c) 淡红色，中心色较深的菌落；
d) 挑取不少于3个(不足3个则全挑)可疑菌落，进行革兰氏染色镜检观察。
质控菌株接种到品红亚硫酸钠培养基平板上，培养结果如下图所示：
图4 大肠菌群在品红亚硫酸钠培养基平板上生长情况
注：A：大肠埃希氏菌ATCC 25922；B：大肠埃希氏菌ATCC 8739；C：弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864
4.2.1.4 凡系革兰氏阴性无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，经36℃±1℃培养24h±2h后，如产酸产气则判定为大肠菌群阳性。
图5 大肠埃希氏菌ATCC 25922革兰氏染色镜检结果
图6 质控菌株在乳糖蛋白胨培养液中生长情况
4.2.2 结果与报告
滤膜上的大肠菌群菌落数按下列公式计算，以每100mL水样中的大肠菌群数报告结果：
每100mL水样中大肠菌群菌落数(CFU/100mL)=确证为大肠菌群菌落数(CFU)×100/过滤的试样量(mL)
举例说明：
滤膜上有100个典型菌落，挑取10个典型菌落（可疑菌落）做革兰氏染色镜检，发现有8个菌落为革兰氏阴性无芽孢杆菌，这8个菌落接种乳糖蛋白胨培养液，培养后，有6支管产酸产气，为大肠菌群阳性。
则每100mL水样中大肠菌群菌落数为：（100×6/10×100）/100=60（CFU/100mL）
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