一、参考标准

  《GB5009.211-2014食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》

二、方法原理

  叶酸是鼠李糖乳杆菌Lactobacillus casei spp.rhamnosus（ATCC7469）生长所需的营养素，在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌液接种至含有式样液的培养液中，培养一段时间后测定透光率（或吸光度值），根据叶酸含量与透光率（或吸光度值）的标准曲线计算出试样中叶酸的含量。

三、试验用品及预处理

  （1）培养基：叶酸测定用培养基。

  （2）磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，PH6.8）、氢氧化钠乙醇溶液（0.01mol/L）、鸡胰腺溶液、蛋白酶-淀粉酶液纯化水等。

  （3）容器：试管、移液管、容量瓶、量筒、玻璃棒、锥形瓶。

  注意事项：

  1.本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。水的洁净程度对本试验至关重要，若水中有叶酸残留或接触了有叶酸残留的容器，将直接影响到试验结果；

  2.试验中使用的玻璃器具需洗净后在200℃烘至少2h，必要时可预先用1mol/L的稀盐酸浸泡再烘，充分去除容器中可能残留的叶酸；

  3.使用的叶酸测定培养基需确保不含有叶酸，其他营养齐全。若自行配制培养基，需确保原材料中不含有叶酸，制备过程不可污染叶酸。

四、标准溶液的制备

  （1）叶酸标准贮备液（20.0 μg /mL）：精确称取20.0mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解转移至1000mL棕色容量瓶中，定容至刻度。

  （2）叶酸中间液（0.200ug/mL）：用氢氧化钠乙醇溶解将1.0mL叶酸贮备液定容至100mL棕色容量瓶。

  （3）叶酸标准工作液（0.200 ng/mL）：用水将1.0mL叶酸中间液定容至1000mL容量瓶。

  注意事项：

  1.标准溶液配制过程中使用的溶剂、容器必须确保无叶酸残留；

  2.叶酸贮备液存于棕色瓶中，于2℃-4℃冰箱可保存2年，中间液可保存1年，标准工作液临用前配制。

四、菌株活化及菌悬液制备

  （1）将鼠李糖乳杆菌（ATCC 7469）转接至琼脂培养基中，在37℃±1℃培养箱中培养20h-24h，连续传中2代-3代。

  （2）实验前一天，取2mL叶酸标准工作液与4mL叶酸测定用培养液混匀，分装至2支5mL离心管中，于121℃高压灭菌 15 min 即为种子培养液。待冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中，于37℃±1℃培养箱培养20h-24h。将种子培养液混匀，无菌操作下吸取0.5mL转种至另2支已消毒但不含叶酸的培养液中，37℃±1℃培养6h，振荡混匀，制成接种液，立即使用。

  注意事项：制备菌株过程需注意严格进行无菌操作，防止污染杂菌。

五、样品处理

  （1）直接提取法：称取固体试样或液体试样0.5g-2g（精确到0.001g），转入100mL锥形瓶中，加入80mL氢氧化钠乙醇溶液，超声振荡2h-4h至试样完全溶解或分散，用水定容至刻度。

  （2）酶解提取法：称取适量试样（精确到0.001g），转至100mL锥形瓶中，加入30mL磷酸缓冲液，振摇5min后，于121℃高压水解15min；待试样冷却至室温，加入1mL鸡胰腺溶液（含有蛋白质、淀粉的试样需另加入1mL蛋白酶-淀粉酶液）混合，加入3滴-5滴甲苯后，置于37℃±1℃培养箱内酶解16h-20h，取出转入100mL容量瓶，加水定容至刻度，过滤。

  注意事项：

  1.形态为颗粒、粉末、片剂、液体的营养补充剂或强化剂、预混料；以饮料为基质或叶酸添加量＞100ug/100g的食品可采用直接提取法；

  2.以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底叶酸含量，可采取酶提取法。

六、试验步骤

  （1）标准曲线制作：按下表顺序加入水、标准曲线工作液和叶酸测定用培养基于试管中，做3个平行组。

  注意事项：准备标准系列管时另准备一支标准0管（含0.00ng叶酸）不接种作为0对照管。

  （2）试样和酶空白系列管的制作：按下表顺序加入水、试样稀释液和叶酸培养基于试管中，做3个平行组。

  （3）灭菌：将所有试管置于121℃灭菌15min，灭菌结束后，迅速冷却至30℃以下。

   注意事项：不可灭菌时间过长或长时间在灭菌锅中保温，防止培养基中维生素成分过量降解；灭菌后的培养基宜当天使用。

  （4）接种：用滴管或移液器向上述试管中各滴加1滴（约20μL）测试菌液（其中标准曲线管中空白0对照管除外）。

  （5）培养：将试管放入恒温培养箱内，37±1℃培养20h～24h。

  （6）观察：培养结束后，若0对照管有明显的细菌增长，或与0对照管相比，标准0管透光率在90%以下，或标准系列管透光率最大变化量＜40%，说明可能有杂菌或不明来源叶酸混入，需重做实验。

  （7）测定：将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡混匀器混匀。用未接种0对照管调节透光率为100%（或吸光度值为0），依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率（或吸光度值）。

  注意事项：

  1.在进行吸光度测定时，测量的OD值在0.2-0.8之间相对更准确，线性关系更好，若测得OD值超出范围，可进行倍数稀释再进行测定。

  2.叶酸测定适宜的光谱范围540nm-610nm。

  （8）标准曲线制作及计算：以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线。

  试样结果计算：从标准曲线查得试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量（Cx），如果3支试样系列管中有2支叶酸含量在0.10ng-0.80ng范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10%，则可能继续按式（2）、式（3）、式（4）进行结果计算，否则需重新取样测定。

  试样稀释液叶酸浓度按式（2）计算：

  采用酶解提取法的试样叶酸含量按式（4）计算：

  注意事项：

  1.液体试样叶酸含量也可以微克每百毫升（ug/100mL）为单位；

  2.以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

七、实验现象及标准曲线制作

  （1）实验现象：

  （2）标准曲线制作：

八、试验关键点总结

  （1）试验用使用的玻璃容器、水、培养基等必须确保无维生素B12残留，整个试验过程操作要注意不能污染叶酸，否则会导致标准曲线线性关系差或做不出标准曲线；

  （2）标准溶液制备过程中必须精确称量、定容，若配制的标准溶液误差过大会直接影响最终测定结果；

  （3）使用的鼠李糖乳杆菌要连续进行传代至活力旺盛，且无杂菌污染；在进行菌体离心-悬浮清洗的重复操作时，需确保清洗干净，不能有活化培养基残留，残留的培养基中可能含有叶酸，对试验结果造成不良影响；

  （4）进行OD值测定时，尽可能保证测得吸光度范围在0.2-0.8之间，若超出此范围，可使用空白培养基进行倍数稀释后再进行测定。

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