一、参考标准
《GB5413.14-2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》
二、方法原理
利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）对维生素B12的特异性和灵敏性，定量测定出试样中维生素B12的含量。
在测定用培养基中供给除维生素B12以外的所有营养成分，这样莱士曼乳杆菌生长浓度（吸光度）就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素B12的含量呈正比的线性关系。以不同浓度标准溶液的维生素B12含量为横轴，以莱士曼乳杆菌生长浓度（吸光度）为纵轴，即可绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中维生素B12的含量。
三、试验用品及预处理
（1）培养基：维生素B12测定用培养基；
（2）磷酸氢二钠、无水偏重亚硫酸钠、柠檬酸、生理盐水、25%乙醇、纯化水等；
（3）容器：试管、移液管、容量瓶、量筒、玻璃棒、锥形瓶。
注意事项：
①本方法所用试剂均为分析纯试剂，水为GB/T 6682规定的二级水。水的洁净程度对本试验至关重要，若水中有维生素B12残留或接触了有维生素B12残留的容器，将直接影响到试验结果。
②试验中使用的玻璃器具需洗净后在200℃烘至少2h，必要时可预先用1mol/L的稀盐酸浸泡再烘，充分去除容器中可能残留的维生素B12。
③使用的维生素B12测定培养基需确保不含有维生素B12，其他营养齐全。若自行配制培养基，需确保原材料中不含有维生素B12，制备过程不可污染维生素B12。
四、标准溶液的制备
（1）维生素B12贮备液（10μg/mL）：精确称取维生素B12标准品，用25%乙醇溶液定容至维生素B12浓度为10μg/mL。
（2）维生素B12中间液（100ng/mL）：用25%乙醇溶液将5.0mL维生素B12贮备液定容至500mL。
（3）维生素B12工作液（1ng/mL）：用25%乙醇溶液将5.0mL维生素B12中间液定容至500mL。
（4）标准曲线工作液：分别吸取两个5mL维生素B12工作液于250mL和500mL容量瓶中，用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02ng/mL；低浓度溶液的浓度为0.01ng/mL。
注意事项：
①标准溶液配制过程中使用的溶剂、容器必须确保无维生素B12残留。
②所有标准溶液要储存于冰箱内。维生素B12贮备液、中间液、工作液可保存三个月，标准曲线工作液临用前配制。
五、菌株活化及菌悬液制备
（1）将莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）菌株活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36±1℃培养24h。再转种2代～3代来增强活力。置2～5℃冰箱保存备用。每15d转种一次。
（2）将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36±1℃培养18h～24h，以2000转/分钟离心2～3min，弃去上清液，加入10mL生理盐水，振荡悬浮混匀，再离心2～3min，弃去上清液，再加入10mL生理盐水，振荡悬浮混匀。再离心，弃去上清液。再加10mL生理盐水，振荡悬浮混匀。吸适量该菌悬液于10mL生理盐水中，混匀制成透光率为60%-80%的测试菌液（以生理盐水做空白，用分光光度计测550nm波长下的透光率）。
注意事项：
①莱士曼乳杆菌初次复苏时活力较差，生长缓慢，必须连续转接传代2-3代或更多代数至菌株活力旺盛，方可用于试验。
②莱士曼乳杆菌可连续传代数十次仍然保持菌株特性稳定，可在传代5次之后继续使用（多数标准都规定传代次数一般不可超过5代，而莱士曼乳杆菌可以多次传代）。
③制备菌株过程需注意严格进行无菌操作，防止污染杂菌。
④制备菌悬液过程中的重复离心-去上清-生理盐水悬浮步骤目的为洗去活化培养基中的维生素残留，不可省略或减少清洗次数，若清洗不干净，可能会对试验结果造成不良影响。
六、样品处理
（1）称取无水磷酸氢二钠1.3g，无水偏重亚硫酸钠1.0g，柠檬酸（含一个结晶水）1.2g，用100mL水溶解。
（2）称一定量的样品 (精确到0.0001g)，含维生素B12约50-100ng，用10mL的上述溶液混合后，再加150mL水，于121℃水解10min，冷却后调pH至4.5±0.2，再用水定容至250mL，过滤。移取滤液5mL，加入水20～30mL，调pH至6.8±0.2，用水定容至100mL。最终溶液中维生素B12的质量浓度约在0.01 ng/mL～0.02ng/mL，偏重亚硫酸钠的质量浓度小于0.03mg/mL。
七、试验步骤
（1）标准曲线制作：按下表顺序加入水、标准曲线工作液和维生素B12测定用培养基于试管中，做3个平行组。
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试管 |
S1 |
S2 |
S3 |
S4 |
S5 |
S6 |
S7 |
S8 |
S9 |
S10 |
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水（mL） |
5 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
0 |
2 |
1 |
0 |
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0.01ng/mL标准曲线工作液（mL） |
0 |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
0 |
0 |
0 |
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0.02ng/mL标准曲线工作液（mL） |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
3 |
4 |
5 |
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培养基（mL） |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
（2）待测液的制作：按下表顺序加入水、样品溶液和维生素B12测定培养基于试管中，做3个平行组。
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试管 |
1 |
2 |
3 |
4 |
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水（mL） |
4 |
3 |
2 |
1 |
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待测液（mL） |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
培养基（mL） |
5 |
5 |
5 |
5 |
（3）灭菌：将所有试管置于121℃灭菌5min，灭菌结束后，迅速冷却至30℃以下。
注意事项：不可灭菌时间过长或长时间在灭菌锅中保温，防止培养基中维生素成分过量降解；灭菌后的培养基宜当天使用。
（4）接种：用滴管或移液器向上述试管中各滴加1滴（约50μL）测试菌液（其中标准曲线管中空白S1除外）。
（5）培养：将试管放入恒温培养箱内，36±1℃培养19h～20h。
（6）观察：培养结束后，对每支试管进行目测检查，未接种试管S1内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则测定无效。以接种空白管做对照，测定最高浓度标准曲线试管的透光率，2h后重新测定。两次结果透光率差值若小于2%，则取出全部检验管测其透光率。
注意事项：若S1试管出现浑浊，可能是灭菌不彻底出现了污染；若S2出现明显浑浊，可能是培养基中有维生素B12污染或接种的菌液污染杂菌；两次测定最高浓度标准曲线的透光率差值若＜2%，说明细菌生长已达峰值，可进行测定，反之则需继续培养至最高浓度，方可取出进行测定。
（7）测定：用未接种试管（S1）作空白，将分光光度计透光率调到100%（或吸光度为0），读出接种空白试管（S2）的读数。再以接种空白试管（S2）为空白，调节透光率为100%（或吸光度为 0），依次读出其他每支试管的透光率（或吸光度）。
用涡旋混合器充分混合每一支试管（也可以加一滴消泡剂）后，立即将培养液移入比色皿内进行测定，波长为550nm，待读数稳定30s后，读出透光率（或吸光度），每支试管稳定时间要相同。
注意事项：在进行吸光度测定时，测量的OD值在0.2-0.8之间相对更准确，线性关系更好，若测得OD值超出范围，可进行倍数稀释再进行测定。
（8）标准曲线制作及计算：以维生素B12标准品的含量为横坐标，透光率（吸光度）为纵坐标作标准曲线。
根据待测液的透光率（吸光度），从标准曲线中查得该待测液中维生素B12的浓度，再根据稀释因子和称样量计算出试样中维生素B12的含量。透光率（吸光度）超出标准曲线管S3～S10范围的试样管要舍去。
对每个编号的待测液的试管，用每支试管的透光率（吸光度）计算每毫升该编号待测液维生素B12的浓度，并计算该编号待测液的维生素B12浓度平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有的四个编号的待测液的总管数的2/3，用于计算试样含量的数据是不充分的，需要重新检验。如果符合要求的管数超过原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液中维生素B12含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值为Cx。 用于计算试样中的维生素B12含量。
维生素B12的含量按公式计算：X=Cx/m*f/1000*100
注：X是试样中维生素B12的含量，单位为μg/100g；Cx是计算所得的维生素B12含量总平均值，单位为ng；m是试样的质量，单位为g；f是稀释倍数。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
八、实验现象及标准曲线制作
（1）实验现象：S3-S10试管呈梯度浑浊
（2）标准曲线制作
九、试验关键点总结
（1）试验用使用的玻璃容器、水、培养基等必须确保无维生素B12残留，整个试验过程操作要注意不能污染维生素B12，否则会导致标准曲线线性关系差或做不出标准曲线；
（2）标准溶液制备过程中必须精确称量、定容，若配制的标准溶液误差过大会直接影响最终测定结果；
（3）使用的莱士曼乳杆菌要连续进行传代至活力旺盛，且无杂菌污染；在进行菌体离心-悬浮清洗的重复操作时，需确保清洗干净，不能有活化培养基残留，残留的培养基中可能含有维生素B12，对试验结果造成不良影响；
（4）进行OD值测定时，尽可能保证测得吸光度范围在0.2-0.8之间，若超出此范围，可使用空白培养基进行倍数稀释后再进行测定。
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