一、参考标准

  《SN/T 2206.3-2009 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 化妆品微生物检验方法 第3部分：肺炎克雷伯氏菌》。

二、生物学特征

  革兰氏阴性杆菌，为较短粗的杆菌，大小0.5～0.8×1～2 um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，在普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。

三、检验程序

图1 肺炎克雷伯氏菌检验程序

四、检验方法及结果

  1、增菌

  肺炎克雷伯氏菌在SCDLP液体培养基中36±1℃培养18-24h后生长浑浊。如图2所示。

a:空白对照 b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

图2 SCDLP液体培养基培养结果

  2、选择性分离

  自SCDLP培养液中，取1-2接种环，划线接种于胆硫乳琼脂平板（DHL）上，置36±1℃ 培养18-24 h。

  在DHL平板上肺炎克雷伯氏菌菌落呈淡粉红色，大而隆起，光滑湿润，粘液状，相邻菌落容易融合成脓汁样，接种针挑取菌落时呈丝状粘连。如图3所示。

图3 肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117在DHL平板上的培养结果

五、初步生化鉴定

  从DHL平板上至少挑取5个典型或可疑菌落，如果平板上可疑菌落少于5个，则全部挑取，把挑取的可疑菌落分别穿刺于动力半固体琼脂，并接种到营养琼脂斜面培养基，36±１℃培养18-24 h。将营养琼脂斜面培养基上的纯培养物做革兰氏染色、氧化酶试验。

  1、动力半固体琼脂

  肺炎克雷伯氏菌在动力半固体培养基中无动力，延穿刺线生长。如图4所示，相比较大肠埃希氏菌在动力半固体培养基中有动力，呈扩散生长，培养基会出现浑浊现象。

a:大肠埃希氏菌ATCC 25922 b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

图4 动力半固体培养基培养结果

  2、革兰氏染色

  肺炎克雷伯氏菌染色结果为红色，为革兰氏阴性菌。

图5

  3、氧化酶试验

  肺炎克雷伯氏菌氧化酶试验不变色，为阴性。如图6所示，相比较铜绿假单胞菌变蓝为阳性。

a:铜绿假单胞菌ATCC 9027   b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

图6 氧化酶试验结果

六、后续生化鉴定

  挑取无动力，革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性的菌进行后续生化鉴定。

  1、尿素酶试验

  划线接种于尿素酶生化管培养基中，培养基变为粉红色，为阳性。相比较鼠伤寒沙门氏菌不变色，为阴性。

a:空白对照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028

图7 尿素酶鉴定试验结果

  2、靛基质生化鉴定试验

  将菌接种于胰蛋白水培养基中，36±1℃培养24±2h。培养结束后，滴加Kovacs氏靛基质试剂2-4滴，立即观察现象。肺炎克雷伯氏菌为黄色环，为阴性。相比较大肠埃希氏菌为玫红色环，为阳性。

a:空白对照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大肠埃希氏菌ATCC25922

图8 靛基质鉴定试验结果

  3、MR鉴定试验

  用MR-VP培养基培养结束后，滴加甲基红试剂，立即观察现象，肺炎克雷伯氏菌显黄色，为阴性。相比较大肠埃希氏菌显红色，为阳性。

a:空白对照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大肠埃希氏菌ATCC25922

图9 MR鉴定试验结果

  4、V-P鉴定试验

  用MR-VP培养基培养结束后，滴加V-P试剂，继续培养0.5-4 h，观察现象。肺炎克雷伯氏菌变红，为阳性。相比较大肠埃希氏菌为黄色，为阴性。

a:空白对照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:大肠埃希氏菌ATCC25922

图10 V-P鉴定试验结果

  5、西蒙氏枸橼酸盐利用试验

  划线接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基上，培养基变蓝，为阳性。

a:空白对照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117

图11 西蒙氏枸橼酸盐培养基培养结果

  6、赖氨酸脱羧酶鉴定试验

  接种于赖氨酸脱羧酶肉汤生化管中，用无菌液体石蜡覆盖培养基液面，培养18-24 h。观察现象，肺炎克雷伯氏菌培养基呈紫色，为阳性。相比较，福氏志贺氏菌培养基呈黄色，为阴性。

a:空白对照  b:肺炎克雷伯氏菌CMCC(B)46117  c:福氏志贺氏菌ATCC12022

图12 赖氨酸脱羧酶鉴定试验结果

  注：肺炎克雷伯氏菌生化特性见下表。

  注：本文属银河澳门官网入口原创，未经允许不得转载。

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