1 范围

本标准规定了食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)[Burkholderia gladioli( Pseudomonas cocovenenans subsp. farino f ermentans>]的检验方法。

本标准适用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的检验。

2 设备和材料

2.1 实验室常规灭菌设备。

2.2 冰箱:2℃～8 ℃、—20℃～—30℃。

2.3 恒温培养箱:26 ℃士l ℃,36 ℃士l ℃。

2.4 恒温水浴锅:46℃士l℃。

2.5 显微镜:10倍～100倍。

2.6 均质器。

2.7 离心机:3000 r/min。

2.8 电子天平:感量0.l g。

2.9 比浊计。

2.10 锥形瓶:容量100 mI,500 ml.。

2.11 无菌培养皿:直径90 mm、直径150 mm。

2.12 无菌透明玻璃纸﹑滤纸。

2.13 无菌灌胃器: l ml。

2.14 微生物生化鉴定系统。

2.15 小鼠:18 g～20 g,每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。

3 培养基和试剂

3.1 GVC增菌液。

3.2 改良马铃薯葡萄糖琼脂(mPDA)。

3.3 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。

3.4 PCFA培养基。

3.5 马铃薯葡萄糖半固体琼脂。

3.6 卵黄琼脂。

3.7 革兰氏染色液。

3.8 氧化酶试剂。

3.9 Hugh-Leifson培养基(O/F试验用)。

3.10 蛋白胨水(靛基质试验用)。

3.11 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和V-P试验用)。

3.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基。

3.13 苯丙氨酸培养基。

3.14 糖发酵管。

3.15 半固体琼脂。

3.16 抗O多价血清、型特异性因子血清(O-Ⅲ,O-Ⅳ,O-Ⅴ,O-Ⅵ,O-Ⅶ,O-Ⅷ)。

3.17 生化鉴定试剂盒。

4 检验程序

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验程序见图1。

5 操作步骤

5.1 样品处理

无菌操作称取25 g(mL)样品,置入盛有225 mL GVC增菌液的无菌均质袋中(鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎,加入盛有20 mL.GVC增菌液的无菌均质袋中),用拍击式均质器拍打1 min～2 min;或置入盛有225 mL GVC增菌液的无菌均质杯中,以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min;若样品为液态,振荡混匀。

5.2 增菌

将上述样品增菌液置36℃士1℃培养20 h～24 h。

5.3 分离

用直径3 mm的接种环取增菌液一环,分别划线接种于mPDA平板和PCFA平板,36 ℃士1℃培养24 h～48 h。观察各个平板上生长的菌落,各个平板上菌落特征见表1。

5.4 初筛试验

自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落(低于5个全选),分区划线接种于卵黄琼脂平板﹐36 ℃士l℃培养。挑取培养18 h～24 h的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至48 h士2 h,对于卵磷脂酶阳性,带有虹彩环的单个菌落,接种PDA平板,36 ℃士1 ℃培养24 h士2 h。

5.5 生化试验

从纯培养的PDA平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)生化特征见表2。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。

5.6 血清学分型(可选择项)

5.6.1 菌体抗原的制备

将PDA平板36 ℃士1℃培养24 h士2 h的培养物用无菌生理盐水洗下﹐沸水浴(100 ℃)2 h，3000 r/min 10 min离心弃上清液﹐再用无菌生理盐水稀释至5×108CFU/ml～1×109CFU/ml菌悬液﹐作为凝集试验用抗原。

5.6.2 菌体抗原的鉴定

用多价血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者,依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-V、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果,判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合,但不能与以上血清凝集者,需保留菌株做进一步鉴定。

5.7 毒性试验

5.7.1 产毒培养

将初步鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)的菌株接种PDA平板,36℃士1℃,培养24 h士2 h,用灭菌接种环刮取适量菌苔,加到3 mL无菌生理盐水的试管中,配成1麦氏浓度(McFarland,MCF)的菌悬液(约为108CFU/mL.),用无菌吸管吸取0.5 mL,滴在铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板上,用无菌L棒涂布均匀,26 ℃士1℃培养5 d。取下带菌的玻璃纸,将半固体平板置于100 ℃流动蒸汽灭菌30 min。室温冷却后,置一20 ℃～-30℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化,用无菌吸管吸出冻融液﹐经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中(此为毒素粗提液),4℃避光保存。

同时,将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照﹐按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液﹐4℃避光保存。

5.7.2 毒力测定

取毒素粗提液或经100 ℃水浴蒸发后的5倍～10倍浓缩液﹐灌胃小鼠3只，每只0.5 mL,观察至7 d。若菌株产生米酵菌酸﹐小鼠在灌胃后20 min～24 h内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动,继而行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软﹑抽搐,呈角弓反张状,呼吸急促、死亡。

取阴性对照粗提液或经100 ℃水浴蒸发后的5倍～10倍浓缩液,灌胃小鼠3只,每只0.5 ml.,观察至7 d。小鼠应健康存活。

5.7.3 米酵菌酸测定

毒力测定实验阳性时,分别取毒素粗提液,阴性对照粗提液,按照GB 5009.189执行。

6 结果报告

生化试验符合且毒性试验阳性,报告检出唐莒蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)；生化试验和毒性试验有一项不符合,报告未检出唐莒蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)。

附：GB4789.29-2020唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验 点击下载

附：GB4789.29唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验用培养基核算表 点击下载

GB4789.29  唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验
用途	货号	名称	规格	称量数	需求	每瓶/盒/包可做配制	单价
增菌	HB8591	GVC增菌液	250g	26g/L	225ml/样	每瓶可配42个样	120
分离	HB9153	改良马铃薯葡萄糖琼脂（mPDA)	250g	46g 每升	每个平板20ml	每瓶约300个平板	180
	HB9140	PCFA培养基	250g				280
	HB9140a	PCFA培养基添加剂	1ml*5支	每200ML加入一支   每250g需要配8包			80
初筛	待定	卵黄琼脂培养基基础	250g	48g 每升	每个平板20ml	每瓶约260个平板	140
	HB8295	50%卵黄乳液	5ml*10支		10支		65
	HB2100	氧化酶试纸	10片			可以使用10次	25
	HB8278	革兰氏染色液	5ml*8			可以使用30次	40
纯化	HB0233	马铃薯葡萄糖琼脂	250g	46g 每升	每个平板20ml	每瓶约300个平板	160
产毒培养	HB0233-2	马铃薯葡萄糖半固体琼脂	250g	31g每升			120
生化鉴定	GB049	OF生化管	20支				35
	GB117	葡萄糖	20支				30
	GB144-1	果糖	20支				35
	GB032	木糖	20支				40
	GB152	半乳糖	20支				35
	GB163	阿拉伯糖	20支				30
	GB169	蔗糖	20支				25
	GB107	核糖醇（侧金盏花醇）	20支				40
	GB007	甘露醇	20支				30
	GB105	肌醇	20支				35
		卫茅醇	20支				30
	GB008	半固体琼脂	20支				30
	GS004	尿素	20支				30
	GB066	明胶生化管	20支				40
	GB033	硝酸盐还原	20支	需配套硝酸盐还原试剂盒			30
	GS011	西蒙氏枸橼酸盐	20支				30
	GB113	L-精氨酸双水解酶	20支				35
	SN043	氨基酸脱羧酶对照	20支				30
	HB8801	石蕊牛奶培养基	250g	101.67g每升	每管5-10ml		130
	GS001	蛋白胨水	20支	需滴加靛基质试剂盒			30
	GS003	MR-VP生化管	20支	需要配套甲基红试剂盒、V-P试剂盒			30
	GB095	苯丙氨酸脱氨酶	20支	需滴加如下指示剂			30
	GB095a	苯丙氨酸指示剂	5ml*4				30
	GB065	硫化氢	20支				30

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