1.以无菌操作方式开启菌种管，加入适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0 mL～10.0 mL营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，即为第3代培养物。 

  2.用10.0 mL吸管吸取5.0 mL～10.0 mL第3代～5代的18 h～24 h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶（或细胞培养瓶）营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满培养基表面，将多余肉汤培养物吸出，罗氏瓶（或细胞培养瓶）置36 ℃±1 ℃恒温培养箱内培养5 d～7 d。

  3.用接种环取少许菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接种环取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通过火焰加热将菌固定于玻片上；将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液，将平皿盖好，置55 ℃±1 ℃加热30 min。取出，去滤纸，用自来水冲去残留液；加0.5%沙黄水溶液，1 min后水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。在显微镜（油镜）下镜检，当芽胞形成率达90%以上时，即可进行以下处理。否则，继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。

  4.加10.0 mL无菌蒸馏水于罗氏瓶（或细胞培养瓶）中，以L棒轻轻刮下菌苔，吸出，再加入5.0 mL无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中，振摇5 min。 

  5.将烧瓶置45 ℃水浴24 h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。

  6.用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除琼脂凝块。

  7.将芽胞悬液置无菌离心管内，以3000 r/min速度离心30 min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，本步骤重复进行3遍。

  8.将洗净的芽胞悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内，80 ℃水浴10 min（或60 ℃水浴30 min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装后冷藏保存备用，有效使用期6个月。

  9.芽胞悬液在使用时，先进行活菌培养计数。

  10.怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。

  本文节选自中华人民共和国卫生行业标准《WS/T 683—2020消毒试验用微生物要求》。

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