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鞭毛染色法及活细菌运动性的观察



录入时间:2008-10-28 11:07:43 来源:青岛海博

一、目的要求
1 .学习并初步掌握鞭毛染色法,观察细菌鞭毛的形态特征.
2 ,学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性,
二、基本原理
鞭毛是细菌的运动“器官,细菌是否具有鞭毛,以及鞭毛者生的位里和数目是细茵的一项孟要形态特征.细菌的椒毛很纤细,其直径通常为0 . 01 ~0.02um ,所以,除了很少数能形成.毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外,一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到,而只能用电子显微镜观察.要用普通光学显微镜观寮细菌的鞭毛,必须用鞭毛染色法.
鞭毛染色的基本原理,是在染色前先用媒染剂处理,使它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色.鞭毛染色方法很多,本实验介绍硝酸银染色法和改良的Uifson 氏染色法,前一种方法更容易掌握.但染色剂配制后保存期较短.
在显微镜下观察细菌的运动性,也可以初步判断细菌是否有彼毛.细菌运动性的观察可用压清法和悬滴法。观察时,要适当减弱光强度以增加反差,若光线太强.细菌和周围的液体难以区分.
三、器材
1 .菌种 苏云金芽孢杆菌,假单胞菌,金黄色花萄球菌.
2 .染色剂 硝酸银鞭毛染色液,Leifson氏鞭毛染色液,0.01 %美蓝水溶液.
3 .仪器或其他用具 载玻片,盖玻片,凹载玻片,无菌水,凡士林,显微镜等.
四、操作步骤
(一)鞭毛染色
1 .硝酸银染色法
( l )菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种,通常要连续移种1 一2 次,然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种:a取新配制的营养琼脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种,28 ? 32 ℃ 培养10~14h ,取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料;杠取新制备的营养琼脂(含0.8~ 1 . 0 %的琼脂)平板,用接种环将新鲜菌种.点种丁平板中央,28 ~32 ℃ 培养18 ~30h ,让菌种扩散生长,取菌落边缘的菌苔(不要取菌落中央的菌谷)作染色观察的菌种材料.
( 2 )载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20 例n ,取出用清水充分洗净,沥干水后置95 %乙醇中,用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
( 3 )菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1 一2 刘无菌水的试管中,制成轻度混浊的菌悬液用于制片.也可用培养物直接制片,但效果往往不如先制备菌液。挑菌时,尽可能不带培养基。
( 4 )制片取一滴菌液于载玻片的一端,然后将玻片倾斜,便菌液缓缓流向另一端,用吸水纸吸去玻片下端多余菌液,室温{或37 ℃ 温室)自然千燥.
干后应尽快染色不宜放,时间过长,
( 5 )染色涂片干燥后,滴加硝酸银染色A 液顶盖3 一5 min ,用熏馏水充分洗去A 液.用B 液冲去残水后,冉加B 液夜盖涂片染色约数秒至l 而n ,当涂面出现明显褐色时,立即用蒸馏水冲洗,若加B 掖后显色较慢,可用微火加热,直至显揭色时立即水洗,自然干燥.
配制合格的染色荆(尤其是B 波)、充分洗去A 液再加B 液、水姐好。浪的染色时闻均丹.毛染色成欣的,.环节。
( 6 )镜检干后用油镜观察。观察时,可从玻片的一端逐渐移至另一端,有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛.
菌体呈深褐色,鞭毛显褐色、通常呈波浪形.
2 改良的Leifson氏染色法
( 1 )载玻片的准备菌种材料的准备同硝酸银染色法.
( 2 )制片用记号笔在载玻片反面将玻片分成3 一4 个等分区,在每一小区的一端放一小滴菌液.将玻片倾斜,让菌液流到小区的另一端,用滤纸吸去多余的菌液.室温或37 ℃ 温室自然千燥.
( 3 )染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面,隔数分钟后,加染液于第二区涂面,如此继续染第三,四区.间隔时间自行议定,其目的是为了确定最佳染色时间.在染色过程中仔细观家,当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时,即直接用水轻轻冲洗(不要先倾去染料再冲洗,否则背景不清).染色时间大约10min.自然千燥.
( 4 )镜检干后用油镜观察
菌体和鞭毛均呈红色.
(二)运动性的观察
玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法.
1 .压滴法
( l )制片 在洁净载玻片上加一滴无菌水,挑取一环菌液与水棍合,再加一环0 . 01 %的美蓝水溶液与其混合均匀.用镊子取一沽净盖玻片,使其一边与菌液边缘接触,然后将盖玻片慢怪放下盖在菌液上.观察专性好氧菌时,可在放盖玻片时压人小气泡,以防止细菌因缺氧而停止运动.( 2 )镜检先用低倍镜找到标本,再用高倍镜观察。也可用油镜观寮,用油镜时,盖玻片厚度不能超过017 ? ,观察时,要用略暗光线,
有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动,两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随水流动相区别.
2 .悬滴法
(1)涂凡士林取沽净凹载玻片,在其四周涂少许凡士林
 ( 2 )加菌液在盖玻片中央滴一小滴菌液.为便于观察时寻找曲液位t ,可用记号笔在菌液周围画上记号。菌液不能加得太多,为了便于观察,也可用接种环挑取一环菌液于益玻片中央. 
( 3 )盖凹玻片将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液,井轻轻盖在盖玻片上.轻轻按压使盖玻片与凹玻片粘合在一起,把液摘封闭在小室中。翻转凹玻片,使菌液滴惫在益玻片下并位于凹槽中央. 
(4) 镜检 先用低倍镜找到标本,并将液滴移至视野中央,然后用高倍镜观察.若用油镜观察,盖玻片厚度不能超过O . 17mm , ,并要十分细心,以免压碎盖玻片、报坏镜头.
五、实验报告
l 结果
你所观察的3 种细菌是否都有鞭毛?是否都能运动?鞭毛― 运动有无相关性?绘图表示有鞭毛细菌的形态特征.
2 .思考题
( l )用鞭毛染色法准确鉴定一株纽菌是否具有鞭毛,要注意哪些环节?
( 2 ) 悬滴法中,为什么要涂凡士林?为什么加的菌液不能大多?如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动,你认为是什么原因造成的?
   
   

 

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