益生菌活菌计数方法现状
随着益生菌功能研究的深入，益生菌越来越多地应用于食品和保健食品中，“ 活菌数”是保证其相关产品质量的一个关键指标。提高益生菌活菌计数方法的准确性和稳定性，可以为企业生产过程中对益生菌相关产品质量的控制、提升食品质量安全水平提供技术支撑，同时可以更好地应用于监管部门的专项抽查、风险监控、执法检验等活动中。
目前较普遍使用的益生菌活菌计数方法是参照国家标准GB 4789.35-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。
食品用乳酸菌主要分为两大类:一类是食品加工用乳酸菌;第二类是具有健康功能的活的乳酸菌，又称益生菌。与食品加工用乳酸菌特征指标不同的是，益生菌产品的活菌数通常都很高，可达到100亿至1000亿以上，而冷冻干燥菌粉原料中活菌数甚至可达到1000亿至10000亿，且生产日活菌添加量与保质期内活菌稳定性通常是益生菌产品最关键的质量标准和功效指标，也是衡量益生菌原料与终端产品市场价值最核心与关键的因素。现行国标在实际应用中发现，进行高活菌密度、某些特殊剂型及配方或含有某些新菌种的益生菌产品的活菌计数时，常常出现结果不稳定或检验结果明显低于生产时活菌添加量的情况。
影响计数结果最主要的影响因素包括稀释液和计数培养基。样品稀释时，三个因素对活菌的准确计数影响最大:稀释比例、稀释液组成和pH值。综述前人的研究经验(2):样品制备的稀释比例为1:5-1:10 ;稀释后样品悬液的pH值最好与最佳生长pH值-致;因益生菌具有氧敏感性,稀释液中应该含有抗氧化剂。日本研究者Masamichi MUTO和Fumiaki ABE等(2010年)在研究了多种稀释液配方后认为，Mitsuoka' s缓冲液适用于含有严格厌氧的双歧杆菌活菌产品的稀释，该缓冲液含有磷酸盐、半胱氨酸和吐温80,前2个成分分别具有缓冲能力、抗氧化能力，而吐温80则可改善产品在稀释液中的分散能力。(3)目前国标方法选用的培养基如下:以MRS琼脂(厌氧)为总乳酸菌计数培养基;在含有多菌种的产品中，以添加有莫匹罗星抗生素的MRS琼脂(厌氧)作为双岐杆菌选择性计数培养基，以MC琼脂(需氧)为嗜热链球菌选择性计数培养基，以总乳酸菌数减去双歧杆菌和嗜热链球菌数为乳杆菌数。但是,近年来,综述多个研究结果(2, 3)，RCM培养基可提高冷冻干燥双歧杆菌的活菌计数准确性。
此外，本实验室多年来采用GB 4789 .34-2003《食品卫生微生物学检验双岐杆菌检验》中推荐的TPY琼脂培养基用于乳酸菌的计数，发现其用于益生菌产品的活菌计数结果较稳定。
为此，本研究比较了两种稀释液及几种计数培养基对两类代表性益生菌产品(冷冻干燥活菌粉原料和益生菌颗粒产品)活菌计数结果的影响，以确定更符合益生菌产品特点的活菌计数方法。
材料和方法
试剂及培养基
生理盐水; Mitsuoka' s缓冲液(6.0g Na2HPO, 4.5 g KH2PO,，0.5g L-半胱氨酸盐酸盐，0.5g吐温80，1000mL蒸馏水);MRS琼脂、TPY琼脂(青岛海博) ; RCM琼脂(OXOID)。改良MRS、改良TPY和改良RCM琼脂分别为添加有50μg/ml莫匹罗星锂盐(青岛海博)。
样品
所用样品为嗜酸乳杆菌LA11-ONLLY冷冻干燥活菌粉(3000亿CFU/g)、长双歧杆菌BL88-ONLLY冷冻干燥活菌粉(3000亿CFU/g)和昂立1号益生菌颗粒(国食健字G20060027)产品，均来自上海交大昂立股份有限公司，各选取三个批号的样品进行平行检验。
实验方法
称取2.00g士0.01g样品，分别至18ml生理盐水或Mitsuoka' s缓冲液中，均质1 min,静置5 min,分别用生理盐水或Mitsuoka's缓冲液梯度稀释至合适浓度。
乳杆菌菌粉计数
以MRS、TPY琼脂培养基，分别置于37°C厌氧、好氧条件下培养48-72小时，比较不同稀释液和培养基对计数结果的影响。
双歧杆菌菌粉计数
以MRS、TPY和RCM琼脂培养基，分别置于37°C厌氧培养48-72小时，比较不同稀释液和培养基对计数结果的影响。
冷冻干燥活菌粉的计数结果
乳杆菌冷冻干燥菌粉
由于乳杆菌为兼性厌氧菌，在好氧和厌氧条件下均可生长，本研究以生理盐水或Mitsuo-ka’s缓冲液为菌粉稀释液，以MRS或TPY为培养基,分别在好氧和厌氧进行培养。三批嗜酸乳杆菌LAI1-ONLLY菌粉采用不同方法计数的结果见表1和图1。
从结果看出，培养方式对计数结果影响很小;而稀释液对计数结果有显著影响。用生理盐水稀释和用Mitsuoka's缓冲液稀释后计数结果分别为3.95×1011cfu/g
和4.47×1011cfu/g，用生理盐水作为稀释液可检出的活菌仅为Mitsuoka' s缓冲液的87%。
双歧杆菌冷冻干燥菌粉
双歧杆菌与乳杆菌不同，为严格厌氧菌，仅在厌氧条件下生长。分别考察两种稀释液和三种培养基对长双歧杆菌BL88-ONLLY菌粉计数结果的影响，结果见表2。
从表2结果可见，菌粉稀释液和培养基均对计数结果产生了显著影响，Mitsuoka' S缓冲液与RCM琼脂组合检出的活菌数最高，以此为100%，那么Mitsuoka' s缓冲液与MRS和TPY组合的计数结果分别为36%和98%;而用生理盐水，MRS、TPY和RCM计数结果仅分别25%、76%和78%，生理盐水作为稀释液对活菌细胞影响较大，会影响计数结果。
益生菌颗粒计数结果
稀释液对pH值的影响
对昂立1号‘益生菌颗粒连续3个批号，分别采用生理盐水和Mitsuoka'S缓冲液溶解并测定pH值，结果见表3。生理盐水稀释液pH值为4.41,而Mitsuoka' s缓冲液组的为6.56。可见，稀释液对样品匀液的pH值影响较大。
益生菌颗粒总乳酸菌计数
采用生理盐水和Mitsuoka’s缓冲液进行样品稀释，分别以MRS、TPY和RCM厌氧培养进行总乳酸菌计数，结果见表4。Mitsuoka' s缓冲液与RCM组合的计数结果记为100%，则MRS和TPY的结果分别为85%和98%，而用生理盐水时三种培养基结果分别为60%、74%和72%，这表明，MRS用于乳杆菌和双歧杆菌复配产品的总乳酸菌计数时，结果偏低，Mitsuoka’s缓冲液、TPY和RCM培养基厌氧培养更适用于本产品中总乳酸菌计数。
益生菌颗粒长双歧杆菌选择性计数
用Mitsuoka' s缓冲液溶解后，以改良MRS、改良TPY和改良RCM厌氧培养，并与国标比较，结果见表5。以改良RCM结果为100%,改良TPY结果为96%左右，而改良MRS结果只有71%左右。可见，MRS不适于长双歧杆菌的活菌计数，RCM或TPY更适合。国标方法(生理盐水/改良MRS培养基)的计数结果仅为59%左右，推荐使用Mitsuoka' S缓冲液、改良TPY或改良RCM培养基厌氧培养进行益生菌颗粒产品长双歧杆菌选择性计数。
益生菌颗粒嗜酸乳杆菌选择性计数
用国标方法(生理盐水/ MRS厌氧培养总数减去改良MRS厌氧培养数)、Mitsuoka' s缓冲液/MRS/好氧培养、Mitsuoka' s缓冲液/TPY/好氧培养方法进行选择性计数，结果见表6。以Mitsuoka' S缓冲液/TPY/好氧培养方法计数结果为100%,Mitsuoka' S缓冲液/MRS/好氧培养结果约为95%，而国标方法结果仅为55%。根据本实验结果，推荐使用Mitsuoka’s缓冲液、MRS或TPY好氧条件下进行益生菌颗粒中嗜酸乳杆菌选择性计数。
讨论
推荐用于冷冻干燥活菌粉的稀释液和培养基。稀释液对结果的影响可能是由于高密度菌粉本身呈酸性，若菌粉稀释液呈酸性，可能会对细胞造成伤害，而Mitsuoka's缓冲液添加了磷酸盐作为缓冲体系以及吐温80作为细胞膜表面活性剂，可以保护细胞在溶解复水过程中免受损害。经过本实验，推荐Mitsuoka' S缓冲液作为冷冻干燥活菌粉的菌粉和梯度稀释液;推荐MRS和TPY琼脂好氧培养用于乳杆菌冷冻干燥活菌粉的计数;推荐TPY和RCM琼脂厌氧培养用于双歧杆菌冷冻干燥活菌粉的计数。
推荐用于益生菌产品的稀释液和培养基。Mitsuoka's缓冲液比生理盐水更适合用于该活菌产品的稀释。益生菌颗粒为乳杆菌与双歧杆菌及其它辅料复配而成的产品。本研究推荐用TPY或RCM在厌氧条件下检验总乳酸菌数，采用MRS或TPY在好氧条件下检验嗜酸乳杆菌数，采用以莫匹罗星锂盐改良的TPY或改良RCM在厌氧条件下检验长双歧杆菌数。
结论
通过比较研究，发现Mitsuoka' s缓冲液更适用于益生菌活菌样品溶解与梯度稀释。对乳杆菌活菌粉，推荐采用MRS或TPY于好氧或厌氧条件下计数;对双歧杆菌活菌粉，推荐采用TPY或RCM于厌氧条件下计数;对乳杆菌和双歧杆菌混合复配产品，推荐采用TPY或RCM于厌氧条件下进行总乳酸菌计数，采用莫匹罗星锂盐改良的TPY或改良RCM于厌氧条件下进行双歧杆菌选择性计数，采用MRS或TPY于好氧条件下进行嗜酸乳杆菌选择性计数。
本文转载自上海交大昂立股份有限公司 张旻 杭晓敏
