1 方法来源
FDA/BAM Chapter 9 Vibrio2004
2 适用范围
本程序规定了食品中创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的检验方法。本程序适用于食品中创伤弧菌的检验。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
3.1 恒温培养箱：36℃±1℃、39.5℃±0.5℃。
3.2 冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃。
3.3 恒温水浴箱：36℃±1℃。
3.4 均质器或无菌乳钵。
3.5 天平：感量0.1 g。
3.6 无菌试管：18 mm×180mm、15mm×100mm。
3.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。
3.9 无菌培养皿：直径90mm。
3.10 无菌手术剪、镊子。
3.11 PCR仪。
3.12 电泳装置。
3.13 凝胶分析成像系统。
3.14 PCR超净工作台。
3.15 高速台式离心机（15000r/min）。
3.16 微量可调移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）和相应吸头。
4 培养基和试剂
4.1 3％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。
4.2 改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂：见附录A中A.2。
4.3 纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂：见附录A中A.3。
4.4 3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.4。
4.5 3％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.5。
4.6 嗜盐性试验培养基：见附录A中A.6。
4.7 3％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。
4.8 3％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。
4.9 3％氯化钠溶液：见附录A中A.9。
4.10 氧化酶试剂：见附录A中A.10。
4.11 革兰氏染色液：见附录A中A.11。
4.12 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：见附录A中A.12。
4.13 Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.13。
4.14 生化鉴定试剂盒。
4.15 DNA提取液。
4.16 6×上样缓冲液。
4.17 0.5×TBE。
4.18 琼脂糖。
4.19 DNA分子量标记物（100 bp-1000 bp）。
4.20 PCR反应配套试剂。
第一法 定性检验
5 检验程序
创伤弧菌检验程序见图1。
6 操作步骤
6.1 样品制备
6.1.1 非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 ℃以下不超过15min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻。
6.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。
6.1.3 以无菌操作取样品25g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或拍击式均质器拍击1min～2min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。
6.2 增菌
将上述1:10样品匀液于36℃±1℃培养18 h～24 h。
6.3 分离
6.3.1 对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于mCPC或CC平板上划线分离。于39℃～40 ℃过夜培养（如果达不到39 ℃～40 ℃，则35 ℃～37 ℃）。
6.3.2 典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈现为圆的、扁平的、中心不透明边缘透明的黄色菌落，直径1 mm～2 mm。
6.4 纯培养
挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18 h～24 h。
6.5 初步鉴定
6.5.1 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。
6.5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。
6.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24 h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，偶尔斜面变黄。
6.5.4 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃±1 ℃培养24 h，观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8％氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。
6.6 确证鉴定
取纯培养物分别接种含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24 h～48 h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒。创伤弧菌的生化性状见表1，创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。
表1 创伤弧菌的生化性状
|
试验项目 |
结果 |
|
革兰氏染色镜检 |
阴性，棒状或弧状 |
|
氧化酶 |
＋ |
|
动力 |
＋ |
|
D-纤维二糖 |
＋ |
|
蔗糖 |
－ |
|
葡萄糖 |
＋ |
|
分解葡萄糖产气 |
－ |
|
乳糖 |
＋ |
|
硫化氢 |
－ |
|
赖氨酸脱羧酶 |
＋ |
|
V-P |
－ |
|
ONPG |
＋ |
|
注：＋阳性；－阴性。 |
|
表2 创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别
|
名称 |
氧 化 酶 |
赖 氨 酸 |
精 氨 酸 |
鸟 氨 酸 |
明 胶 |
脲 酶 |
V ︱ P |
42 ℃ 生 长 |
蔗 糖 |
D ︱ 纤 维 二 糖 |
乳 糖 |
阿 拉 伯 糖 |
D ︱ 甘 露 糖 |
D ︱ 甘 露 醇 |
ONPG |
嗜盐性试验 NaCl含量（％） |
||||
|
0 |
3 |
6 |
8 |
10 |
||||||||||||||||
|
创伤弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
V |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
副溶血性弧菌 V. parahaemolyticus |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
＋ |
－ |
V |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
|
溶藻弧菌 V. alginolyticus |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
|
霍乱弧菌 V.cholerae |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
V |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
拟态弧菌 V.mimicus |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
河弧菌 V. fluvialis |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
V |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
|
弗氏弧菌 V.furnissii |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
|
梅氏弧菌 V. metschnikovii |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
V |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
|
霍利斯弧菌 V. hollisae |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
nd |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
嗜水气单胞菌 A.hydrophilia |
＋ |
V |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
V |
V |
＋ |
V |
V |
V |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
类志贺邻单胞菌 |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
| 注：nd 表示未试验；V 表示可变。 | ||||||||||||||||||||
6.7 PCR鉴定（选做）
6.7.1 DNA模板的制备
取可疑的纯菌落加入500 μL灭菌dH2O中混匀煮沸10 min，15000×g离心3 min。取上清液储存在-20℃直至使用。也可以用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。
6.7.2 PCR扩增
6.7.2.1 引物
|
Vvh-785F |
5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3' |
|
Vvh-1303R |
5' cgc cac cca ctt tcg ggc c 3' |
扩增片段长度：519 bp
6.7.2.2 阴性对照、阳性对照设置
阴性对照(空白对照)以灭菌水作为PCR反应的模板；
阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒）作为PCR反应的模板。
6.7.2.3 PCR反应体系
|
试剂 |
反应体积 |
|
dH2O |
28.2 μL |
|
10× Buffer. MgCl2 |
5.0 μL |
|
dNTPs |
8.0 μL |
|
引物 |
7.5 μL |
|
模板 |
1.0 μL |
|
Taq酶 |
0.3 μL |
|
总体积 |
50.0 μL |
6.7.2.4 PCR反应程序
|
预变性 |
94℃ |
10 min； |
|
变性 |
94℃ |
1 min， |
|
退火 |
62℃ |
1 min， |
|
延伸 |
72℃ |
1 min，25个循环； |
|
终延伸 |
72℃ |
10 min； |
|
保存 |
8℃ |
—— |
6.7.2.5 电泳
用0.5×TBE制备1.5％的琼脂糖凝胶（含EB或Goldview0.5μg /mL，）。各取5 μl PCR产物点样（可包括适量上样缓冲液），用DNA分子量标记物做参照，电压100 V，电泳50 min（根据实验室仪器情况确定具体电泳条件）。使用凝胶成像系统对电泳结果进行保存和分析。
6.8 结果判定
阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未出现519 bp大小的扩增条带，则可判定该样品检验结果为阴性；如待测样品出现519 bp大小的扩增条带，则可判定该样品检验结果为阳性。
如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新进行试验，并排除污染因素。
6.9 报告
根据生化或PCR结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出创伤弧菌。
第二法 MPN计数法
7 操作步骤
7.1 样品制备
同6.1。
7.2 增菌
7.2.1 用灭菌吸管吸取1:10样品匀液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的样品匀液。
7.2.2 另取1 mL灭菌吸管，按6.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支1 mL无菌吸管。
7.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置36℃±1℃恒温箱内，培养18 h～24 h。
7.3 分离鉴定
同定性检测。
8 结果与报告
根据证实为创伤弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）创伤弧菌的MPN值。
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